一种转基因玉米的LAMP扩增和可视化检测方法与流程

本发明属于分子生物学领域，涉及植物转基因检测领域，具体涉及一种环介导等温扩增检测方法。

背景技术：

1、转基因技术在农业领域的应用与发展迅猛，全球转基因作物的商业化种植面积持续增长。玉米(zea mays l.)在世界上很多地区都是重要的主粮作物。转基因技术已经应用于玉米以改善其农艺性状和品质，如耐除草剂转基因玉米dbn9936[1]。玉米作为第二大转基因种植作物，自1996年在美国获得商业化许可后迅速得到推广。转基因作物给人类带来巨大效益的同时也引发了社会关于转基因植物安全性的讨论[2]。开发便捷、高效的转基因检测方法，建立相应检测技术体系对促进转基因农业发展、保护我国农产品进出口贸易、满足市场生物安全监管需求等方面意义重大[3]。

2、转基因玉米dbn9936(原始转化事件c0030.3.5)是北京大北农生物技术有限公司培育的含有cry1ab抗虫基因和epsps耐除草剂基因的转基因玉米新品系。基因操作的受体玉米自交系dbn318，通过农杆菌介导法将目的基因转入受体品种中。

3、目前国内外对转基因产品的检测技术根据检测原理分为基于外源蛋白和基于外源核酸两类。基于外源蛋白的转基因检测技术是以免疫分析技术为基础的对转基因产品的外源表达蛋白进行定性和定量检测的一种技术，常见的方法主要包括酶联免疫吸附技术、western blot技术等[4]。但不同部位不同时期蛋白表达量有差异造成假阳性或假阴性，同时检测结果也受后期加工环节影响。基于外源核酸的检测技术准确性高、稳定性好，主要包括定性pcr技术、定量pcr技术、等温扩增技术等[5]。目前实时荧光定量pcr技术在转基因作物生物安全检测方面已得到国内外广泛开发应用，但需昂贵的荧光pcr仪和配套的试剂，不能普遍适用于现场的即时检测。

4、近年来，随着等温扩增技术发展，环介导的等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，lamp)以其灵敏度高、特异性强、速度快、设备要求低等优点在核酸诊断中得到广泛应用。lamp在转基因玉米检测中也有报道[6]-[7]。因此，在本发明中，我们开发了一种lamp检测引物，用于转基因玉米可视化检测。该方法可在1小时内完成，灵敏度为10am，该方法有望实现在现场转基因玉米的快速检测。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供了一种用于高度特异性玉米转基因的环介导等温扩增(lamp)检测方法。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、本发明提供了一种转基因玉米dbn9936的lamp检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

4、a)设计合成引物；所述引物由上游内部引物fip、下游内部引物bip、上游外部引物f3和下游外部引物b3，上游环引物lf和下游环引物lb组成，所述引物的碱基序列如seq idno：1～6；

5、

6、b)制备3种不同的转基因玉米(mon810、双抗12-5、dbn9936)的基因组核酸；

7、c)配制lamp反应体系并设定反应条件；

8、d)进行lamp方法特异性检测；

9、e)进行lamp方法灵敏度检测；

10、f)进行lamp方法可视化检测。

11、优选地，步骤a)中，所述合成的引物浓度均为10μm。

12、优选地，步骤b)中，所述dna稀释液的浓度为10ng/μl。

13、优选地，步骤c)中，所述lamp反应体系的配置方法为：将2μl的dna稀释液加入到23μl反应体系中；

14、所述23μl的反应体系包括以下体积含量的各组分：

15、

16、

17、lamp反应条件为：65℃扩增反应30min。

18、优选地，步骤d)中，阳性样品为转基因玉米dbn9936，阴性样品设置为转基因玉米mon810、双抗12-5。

19、优选地，步骤e)中，先将dna模板稀释成5个浓度梯度(10000拷贝数、1000拷贝数、100拷贝数、10拷贝数、1拷贝数)，再用lamp方法进行灵敏度测试。

20、优选地，步骤f)中，lamp扩增的产物进行sybr greenⅰ可视化分析，可视化体系：2μl 1000×sybr greenⅰ加入到25μl lamp反应后的液体中。

21、优选地，步骤d)中的扩增结果由实时荧光曲线判读，阳性样品出现扩增曲线，阴性样品及对照无扩增曲线。

22、优选地，步骤e)中的扩增结果由实时荧光曲线判读，出现扩增曲线对应的最低拷贝数就是该检测方法的检测下限(limit of detection，lod)。

23、优选地，步骤f)中的扩增结果由裸眼直接判读，结果读出：有lamp扩增产物显示绿色，则为阳性，无lamp扩增产物显示为橙色。

24、现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

25、1、本发明相比传统的qpcr技术具有灵敏度高，特异性强，精确度好，特别在对低拷贝数和痕量样本具有重要意义。

26、2、本发明中所述的引物设计为特异性引物，来自转基因玉米dbn9936的特异性序列，能够特异的检测转基因玉米品系。

27、3、本发明中lamp引物通过网站设计(https://primerexplorer.jp/e/)，挑选含有lf，lb的最佳引物组合，用于本实验的扩增检测。

技术特征：

1.一种转基因玉米的lamp检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的转基因玉米成分的lamp检测方法，其特征在于，步骤b)中，所述dna稀释液的浓度为10ng/μl。

3.根据权利要求1所述的转基因玉米成分的lamp检测方法，其特征在于，步骤c)中，所述lamp反应体系的配置方法为：将2μl的dna稀释液加入到23μl反应体系中；

4.根据权利要求1所述的转基因玉米成分lamp特异性检测方法，其特征在于，步骤d)中，阳性样品为转基因玉米dbn9936，阴性样品设置为mon810、双抗12-5，以ddh2o为空白对照。

5.根据权利要求1所述的转基因玉米成分lamp灵敏度检测方法，其特征在于，步骤e)中，先将dna模板稀释成5个浓度梯度(10000拷贝数、1000拷贝数、100拷贝数、10拷贝数、1拷贝数)，再用lamp方法进行灵敏度测试。

6.根据权利要求1所述的转基因玉米成分lamp扩增可视化检测方法，其特征在于，步骤e)中，lamp扩增的产物进行sybr greenⅰ可视化分析，可视化体系：2μl 1000×sybr greenⅰ加入到25μl lamp反应体系中。

7.根据权利要求1所述的转基因玉米成分lamp特异性检测方法，其特征在于，对步骤d)中的扩增结果由实时荧光曲线判读，阳性样品出现扩增曲线，阴性样品及对照无扩增曲线。

8.根据权利要求1所述的转基因玉米成分lamp灵敏度检测方法，其特征在于，对步骤e)中的扩增结果由实时荧光曲线判读，出现扩增曲线对应的最低拷贝数就是该检测方法的检测下限(limit of detection，lod)。

9.根据权利要求1所述的转基因玉米成分lamp灵敏度检测方法，其特征在于，对步骤f)中的扩增结果由裸眼直接判读，阳性样品呈现绿色，阴性样品呈现橙色。

技术总结
本发明属于生物学，涉及一种转基因玉米DBN9936的品系基因检测，公开了一种等温扩增技术(LAMP)高效检测转基因玉米的检测方法。本发明包括LAMP引物设计、植物基因组核酸制备、LAMP扩增特异性、灵敏性检测及可视化检测。本发明提出基于LAMP的转基因检测方法，该方法具有灵敏度高、特异性强及可快速现场检测等优点；本方法可为常规核酸检测提供技术方法支持，具有广泛的现场即时检测应用前景。

技术研发人员：张大兵,杨立桃
受保护的技术使用者：浙江予智生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15