一种近红外双光子双模联动响应NTR＆Cys荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于医学检测，具体涉及一种近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、作为一种在缺氧肿瘤细胞中高度表达的内源性酶，硝基还原酶(ntr)与肿瘤组织缺氧程度密切相关。硝基还原酶是肿瘤与癌症并发症的指示性生物标志物，因此被用作癌症的基本诊断和治疗靶点。半胱氨酸(cys)是人体必需氨基酸之一，在维持生物氧化还原稳态中发挥着重要作用。同时cys在肿瘤组织中特别是缺氧环境下呈现较高水平的分布，也可作为一个辅助因素去检测并指示肿瘤微环境。

2、近红外探针和双光子探针由于具有独特的光学性能而被广泛应用于各种疾病标志物分析。基于众多策略，研究者已开发诸多用于监测ntr、cys的近红外或双光子荧光探针。然而，这些探针都只对ntr、cys的独立响应，并且几乎均只强调ntr为肿瘤缺氧的标志物进行分析。而这种方式对于肿瘤缺氧程度的评价方式太过单一，并且会由于各种各样的因素产生难以避免的假阳性信号，从而增加了检测结果的不确定性。此外，目前报道的双响应探针并不兼备近红外与双光子的双模检测功能，这也留给探针开发领域一些研究的空间和机会。

3、因此，如能将ntr和cys两个目标物进行协同检测，则对于准确锁定肿瘤微环境、避免癌症检测误差、以及精准医疗具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题和缺陷，本发明提供了一种近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针及其制备方法和应用，实现了单分子近红外与双光子双通道无干扰连续监测缺氧环境下的ntr与cys，使癌微环境的定位更加准确。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、一种近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针，其结构式如下所示：

4、

5、本发明中，上述近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针的制备方法包括以下步骤：

6、(1)将无水碳酸钾水溶、除氧后重结晶，转移至4-(4-羟基苯基)环己酮与对硝基苄溴的除氧丙酮溶液中，加热回流，反应结束后冷却溶液至室温抽滤，母液以活性碳处理后低温避光浓缩，得黄色固体粗品，以石油醚重结晶，纯化，得化合物2；

7、(2)将新蒸的dmf与ch2cl2置于冷阱中搅拌，后加入至ch2cl2与pocl3组成的混合液并逐渐上升至室温，然后滴入至化合物2中，所得混合物加热回流反应，跟踪反应至完全后，反应液置于冰水中避光过夜，使用乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合液萃取，经无水na2so4干燥、真空旋干得化合物3；

8、(3)将化合物3与乙酸钠混合并加乙酸酐后充分搅拌得混合物，向其中逐滴加入化合物1的乙酸酐溶液，所得混合液置于避光条件下梯度升温反应，反应结束后减压浓缩，并用二氯甲烷-甲醇的混合液洗涤，得化合物4；

9、(4)在氦气保护下，使用新蒸dmf溶解6-羟基-2-萘甲醛和nah搅拌反应，缓慢加入化合物4的dmf溶液，常温避光反应，反应结束后的反应液用二氯甲烷-乙酸乙酯混合液在避光条件下萃取，萃取液置于低温下静置，有机层经无水na2so4干燥、真空减压脱除溶剂得到粗产物，以硅胶柱纯化后得近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针；

10、制备近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针的反应式如下：

11、

12、进一步地，步骤(1)中4-(4-羟基苯基)环己酮与4-硝基苄溴的摩尔比位3：4；步骤(2)中pocl3与化合物2的比例为1ml：1g；步骤(3)中化合物3和化合物1的摩尔比为1：2；步骤(4)中6-羟基-2-萘甲醛、nah与化合物4的摩尔比为5：5：1。

13、进一步地，步骤(2)中dmf、ch2cl2和pocl3的体积比为1：2：1；步骤(3)中，混合物中化合物3与乙酸钠、乙酸酐的质量比为1：1：1，化合物1的乙酸酐溶液中化合物1与乙酸酐的质量比为3.2：1。

14、进一步地，步骤(1)中加热回流的反应温度为60℃，反应时间为13h；步骤(3)中梯度升温条件为4h升温至70℃；步骤(4)中常温避光反应的时间为6h。

15、进一步地，所述的冷阱或低温的温度为-5～-10℃。

16、进一步地，步骤(2)中乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合液中乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷之间的体积比为1：8：1；步骤(3)二氯甲烷-甲醇的混合液中二氯甲烷与甲醇的体积比为10：1；步骤(4)二氯甲烷-乙酸乙酯混合液中二氯甲烷与乙酸乙酯体积比为4：1。

17、本发明中，所述的近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针在制备肿瘤检测试剂中的应用。

18、花菁近红外分子框架极易见光分解，这大大限制了其应用，本发明针对造成分解的强紫外光区进行了基团的改造，在花菁下部引入苯及苄硝基结构，充分利用单分子内滤效应实现了对紫外光区进行吸收，降低了对花菁框架的分解，有效提高了其稳定性，尾端硝基苄结构可敏感触发缺氧环境，并将萘醛基结构引入至花菁中端位置构架无干扰双光子激发模式荧光信号。在近红外荧光框架与cys的触发结构之间，以萘环为连接基团的结构，保证了双光子与近红外激发之间的协同且无干扰分析；同时又以非共轭结构与花菁框架连接，以光致电子转移的效应将消除了花菁框架的荧光背景。此外，对硝基苄的硝基可特异性响应硝基还原酶，从而阻止光致电子转移，使近红外框架释放出荧光。因此，这一分子优化增强了花菁近红外框架的稳定性，实现了对硝基还原酶的高稳定特异性检测。

19、首先，本发明将近红外花菁结构下方连接苯环后，获得了增强的内滤效应，从而避免了低波长光对产品的分解作用，同时该基团可敏感响应缺氧环境。其次，装配在花菁meso-位的萘醛基结构可形成一定的光致电子转移效应，并构建双光子活性中心，且对缺氧环境下的cys分子进行响应，从而产生增强性检测。再次，基于以上各分子部件之间的设计与配合，产品可实现对细胞缺氧环境下的两种因素进行无干扰的双模式可视化监测，具体过程为：在缺氧标志物硝基还原酶的作用下，首先会由关闭状态被触发近红外模式的荧光；随缺氧程度的加剧，荧光会逐渐增强；同时，缺氧环境下的cys会触发双光子活性基团，产生双光子信号。两种模式下的信号所产生的交集区域即为精确缺氧区域，从而提高了肿瘤微环境缺氧检测的保真度。

20、有益效果

21、本发明中的近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针具有缺氧双模可视监测新分子框架，合成了可双模确定缺氧微环境的分子探针，改进了花菁近红外框架的稳定性，并实现高稳定特异性检测缺氧下的硝基还原酶，实现了在缺氧状态下，产品与ntr反应，单光子激发的近红外荧光由淬灭被点亮；同时在缺氧环境下，该探针与cys反应，产生双光子激发的荧光信号；且有效避免了双响应体系的探针消耗问题，同时也保障了荧光激发与发射的无干扰性(双模)，从而真正实现了缺氧微环境的准确锁定。

技术特征：

1.一种近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针，其特征在于，其结构式如下所示：

2.一种权利要求1所示的近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中4-(4-羟基苯基)环己酮与4-硝基苄溴的摩尔比位3：4；步骤(2)中pocl3与化合物2的比例为1ml：1g；步骤(3)中化合物3和化合物1的摩尔比为1：2；步骤(4)中6-羟基-2-萘甲醛、nah与化合物4的摩尔比为5：5：1。

4.根据权利要求2所述的近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中dmf、ch2cl2和pocl3的体积比为1：2：1；步骤(3)中，混合物中化合物3与乙酸钠、乙酸酐的质量比为1：1：1，化合物1的乙酸酐溶液中化合物1与乙酸酐的质量比为3.2：1。

5.根据权利要求2所述的近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中加热回流的反应温度为60℃，反应时间为13h；步骤(3)中梯度升温条件为4h升温至70℃；步骤(4)中常温避光反应的时间为6h。

6.根据权利要求2所述的近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的冷阱或低温的温度为-5～-10℃。

7.根据权利要求2所述的近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中乙酸乙酯-甲醇-二氯甲烷混合液中乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷之间的体积比为1：8：1；步骤(3)二氯甲烷-甲醇的混合液中二氯甲烷与甲醇的体积比为10：1；步骤(4)二氯甲烷-乙酸乙酯混合液中二氯甲烷与乙酸乙酯体积比为4：1。

8.一种权利要求1所述的近红外双光子双模联动响应ntr&cys荧光探针在制备肿瘤检测试剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种近红外双光子双模联动响应NTR&Cys荧光探针及其制备方法和应用，属于医学检测技术领域。近红外双光子双模联动响应NTR&Cys荧光探针的结构式为：本发明中的近红外双光子双模联动响应NTR&Cys荧光探针具有缺氧双模可视监测分子框架，可双模确定缺氧微环境的分子探针，改进了花菁近红外框架的稳定性，并实现高稳定特异性检测缺氧下的硝基还原酶，实现了在缺氧状态下，产品与NTR反应，单光子激发的近红外荧光由淬灭被点亮，同时在缺氧环境下，该探针与Cys反应，产生双光子激发的荧光信号，有效避免了双响应体系的探针消耗问题，同时也保障了荧光激发与发射的无干扰性(双模)，从而真正实现了缺氧微环境的准确锁定。

技术研发人员：高小勇,陈吉,陈光
受保护的技术使用者：江苏辛巴生物医药有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15