黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体及其在忍冬中的应用

本发明涉及黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体及其在忍冬中的应用，属于植物基因工程。

背景技术：

1、金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬(lonicera japonica thunb.)的干燥花蕾或带少量初开的花，是我国传统中药材，具有清热解毒、疏散风热等功效。目前金银花育种基础薄弱，传统育种方法周期长、效率低，导致生产中缺乏良种，严重制约了金银花产业的发展。挖掘金银花关键性状的决定基因，将分子标记辅助育种与传统育种方式结合，是解决金银花生产中良种缺乏的有效途径。然而，由于忍冬稳定遗传转化效率极低，很多基因只能在体外或异源植株中验证功能，缺乏直接的实验证据。为精确研究与忍冬优良性状相关基因的功能，提升突破性忍冬新品种的选育效率，创建新的品种，亟需建立一套高效、稳定、简单的忍冬基因功能研究体系。

2、病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing，vigs)是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后，随着病毒的复制和转录而特异性的诱导序列同源基因mrna降解或被甲基化等修饰，从而引起植物内源基因沉默、引起表型或生理指标变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能。vigs具有操作简便、研究周期短、不需遗传转化等优点，在多种单、双子叶植物中广泛应用。

3、黄瓜花叶病毒(cucumer mosaic virus，cmv)是目前已知的寄主范围最广的植物病毒之一，可侵染100多科2000多种植物。cmv由三个阳性单链基因组rna(rna 1、2和3)组成，表达五种蛋白质。rna 1编码1a蛋白，rna 2编码2a蛋白，它们是参与病毒基因组复制的病毒复制酶的组成部分。rna 2还编码rna沉默的2b抑制因子，2b通过与短干扰rna或双链rna结合来抑制rna沉默。rna 3编码3a运动蛋白和外壳蛋白cp。黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默体系已有诸多报道。现有技术中的黄瓜花叶病毒对忍冬的毒性较强，表型多为：病叶小且出现不同程度的扭曲皱缩，叶片变厚，严重时叶片反卷；茎部节间缩短，茎畸形；重病株簇生小叶，不结瓜，致萎缩枯死，这给基因功能研究带来了诸多不便。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明提供了一种黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体，及其在忍冬中的应用。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一种黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体，由pcmv 101质粒、pcmv 201-de12b质粒和pcmv 301质粒组成，其中，pcmv 101质粒是由cmv rna 1的cdna片段与植物表达载体连接而成；pcmv 201-de12b质粒是由突变改造后的cmv rna 2的cdna片段与植物表达载体连接而成；pcmv 301质粒是由cmv rna 3的cdna片段与植物表达载体连接而成；

4、所述cmv rna 1的cdna片段的核苷酸序列如seq id no.1所示；

5、所述突变改造后的cmv rna 2的cdna片段的核苷酸序列如seq id no.10所示；

6、所述cmv rna 3的cdna片段的核苷酸序列如seq id no.3所示。

7、进一步地，所述植物表达载体选自pcass4-rz载体。

8、所述黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体在植物基因沉默中的应用，在研究植物基因功能中的应用。

9、进一步地，所述植物的种类选自忍冬、烟草、大豆、薄荷等。

10、进一步地，具体应用时，将目标基因的基因片段与pcmv 201-de12b质粒连接构建重组载体，采用农杆菌侵染法侵染植株，检测目标基因的表达水平。

11、进一步地，所述目标基因选自忍冬八氢番茄红素脱氢酶(pds)基因。

12、进一步地，使用实时荧光定量rt-pcr法检测目标基因的表达水平。

13、本发明的黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体，毒性弱(侵染的植株，仅有叶片部分失绿，植株未出现严重受害症状)，可用于忍冬关键基因功能研究，具有快速、高通量、易于操作的优势。本发明为忍冬基因功能研究、忍冬优良品种培育等奠定了基础。

技术特征：

1.一种黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体，其特征在于：由pcmv 101质粒、pcmv 201-de12b质粒和pcmv 301质粒组成，其中，pcmv 101质粒是由cmv rna 1的cdna片段与植物表达载体连接而成；pcmv 201-de12b质粒是由突变改造后的cmv rna 2的cdna片段与植物表达载体连接而成；pcmv 301质粒是由cmv rna 3的cdna片段与植物表达载体连接而成；

2.根据权利要求1所述的黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体，其特征在于：所述植物表达载体选自pcass4-rz载体。

3.权利要求1或2所述的黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体在植物基因沉默中的应用。

4.权利要求1或2所述的黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体在研究植物基因功能中的应用。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：所述植物的种类选自忍冬、烟草、大豆或薄荷。

6.根据权利要求3或4或5所述的应用，其特征在于：具体应用时，将目标基因的基因片段与pcmv 201-de12b质粒连接构建重组载体，采用农杆菌侵染法侵染植株，检测目标基因的表达水平。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述目标基因选自忍冬八氢番茄红素脱氢酶基因。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：使用实时荧光定量rt-pcr法检测目标基因的表达水平。

技术总结
本发明公开了黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体及其在忍冬中的应用，属于植物基因工程技术领域。所述黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体由pCMV 101质粒、pCMV 201‑de12b质粒和pCMV 301质粒组成，其中，pCMV 101质粒是由CMV RNA 1的cDNA片段与植物表达载体连接而成；pCMV 201‑de12b质粒是由突变改造后的CMV RNA 2的cDNA片段与植物表达载体连接而成；pCMV 301质粒是由CMV RNA 3的cDNA片段与植物表达载体连接而成。所述黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体在植物基因沉默中的应用。本发明的黄瓜花叶病毒诱导的基因沉默载体毒性弱，具有快速、高通量、易于操作等优势，可用于忍冬关键基因功能研究。

技术研发人员：蒲高斌,褚洪月,刘谦,李佳,刘振华,张永清
受保护的技术使用者：山东中医药大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13