一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷制备方法及其应用与流程

本发明涉及活性药物领域，具体涉及一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷制备方法及其应用。

背景技术：

1、陈皮(pericarpium citri reticulatae)为芸香科植物橘(citrusreticulatablanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮。始载于《神农本草经》，呈现于上品“橘柚”项下，其味辛、苦，性温，归肺、脾经，是临床常用于调理中枢气机和治疗咳嗽痰多的药食同源的药物。现代研究表明陈皮具有抗炎、抗癌、抗氧化、降血脂等药理活性，并对高血压具有一定的防治作用，还具有解痉平喘、稀化痰液的作用。

2、异槲皮苷，又称槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷，是槲皮素的葡萄糖结合衍生物，常存在于草药、水果、蔬菜和植物源性食品和饮料中。近年来研究发现，异槲皮苷具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗高血压、抗高血糖和利尿作用等生物活性。

3、黄嘌呤氧化酶主要存在于肝脏中，是嘌呤分解代谢的关键酶，可催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，然后黄嘌呤氧化为尿酸(ua)，同时产生活性氧(ros)。当血液中尿酸水平上升时，尿酸结晶并沉积在关节和组织中，形成尿酸钠(msu)，这与痛风和炎症的发生密切相关。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷制备方法及其应用。

2、本发明的目的采用以下技术方案来实现：

3、第一方面，本发明提供一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷的制备方法，包括以下步骤：

4、(1)以陈皮作为原料，经过有机液浸提后，合并浸提液，旋转蒸发仪抽干溶剂，得到有机层提取物ae；

5、(2)将有机层提取物ae溶解，然后过柱分离纯化，等度洗脱，收集组分，为组分ae-3；

6、(3)将组分ae-3再次溶解，分离纯化，洗脱，收集组分，为组分ae-3-7；将组分ae-3-7经核磁鉴定含有异槲皮苷；

7、(4)进行酶活性抑制实验，检测组分ae-3-7对于黄嘌呤氧化酶活性的抑制率。

8、优选地，第(1)步中，浸提是用乙酸乙酯浸泡，并用超声辅助加速浸提，超声频率是20-50khz，重复浸提3次。

9、优选地，第(2)步中，溶解使用的是质量分数为50％的甲醇水溶液，分离纯化使用的是中低压反相c18柱，过柱流速设置30ml/min，洗脱使用的是质量分数为30％的甲醇水溶液，收集的组分为第38～63min的组分。

10、优选地，第(3)步中，溶解是使用纯甲醇溶解，分离纯化是使用sephadexlh-20，流速设置为0.25ml/min，洗脱剂为甲醇，收集组分是收集第1635～1770min组分。

11、优选地，第(4)步中，酶活性抑制实验的过程包括：

12、s1.分别将100μl pbs缓冲液，25μl样品溶液，25μl、0.1u/ml的黄嘌呤氧化酶依次加入至96孔板中，震荡混匀，在37℃下孵育20min；

13、s2.孵育结束后，加入50μl的1mm黄嘌呤反应液，震荡混匀，在37℃下孵育5min；

14、s3.然后在290nm下检测样品孔的吸光度；

15、s4.空白对照组由pbs缓冲液代替样品和黄嘌呤反应液；在完全反应组中，用pbs缓冲液代替样品；样品对照组用pbs缓冲液代替黄嘌呤氧化酶；别嘌呤醇作为阳性对照；

16、s5.样品组黄嘌呤氧化酶的抑制率计算公式如下式1：

17、

18、式中，c1为空白对照组；c2为完全反应组；c3为样品反应组；c4为样品对照组。

19、优选地，第(4)步中，异槲皮苷抑制黄嘌呤氧化酶的ic50值为101.12±1.66μg/ml。

20、第二方面，本发明提供一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷，所述异槲皮苷含有黄酮类化合物异槲皮苷，具有c21h20o12分子式，化学结构如下：

21、

22、第三方面，本发明提供一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷在制备降尿酸血症功能性食品方面的应用，可用于防治高尿酸血症。

23、本发明的有益效果为：

24、1、本发明提供了一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷制备方法及其应用，该方法以陈皮为原料进行分离，原料易得，能够对陈皮进行充分回收利用，避免浪费；制备过程简单易操作；所得的异槲皮苷从陈皮中提取、分离纯化得到，并发现具有抑制黄嘌呤氧化酶活性，可制成降尿酸功能性食品，为降高尿酸血症的防治提供了新的来源，对于药食同源的中药材天然产物有效成分的研究具有十分重要的意义。

25、2、本发明对于使用陈皮作为原料提取异槲皮苷的步骤中进行了优化处理，相比较于传统的先醇沉水提或是水沉醇提法，再有机提取的方式，本发明直接使用有机液进行一次浸提，有机液使用的是乙酸乙酯，同时加以超声辅助，这样相比较于传统的醇沉水提或是水沉醇提法不仅提取方式更简便且更容易得到所需的产物；在提取的过程中，洗脱是本发明比较重要的一部分，包括依次进行的两次洗脱，第一次洗脱是采用30％的甲醇水溶液作为洗脱液，控制洗脱速度(30ml/min)和收集洗脱产物的时间(38～63min)，第二次洗脱采用纯甲醇作为洗脱液，再次控制洗脱速度(0.25ml/min)和收集洗脱产物的时间(1635～1770min)，最终完成洗脱也得到了所需产物。

26、3、本发明最终选择得到的异槲皮苷(组分ae-3-7)在浓度为0.623mg/ml时对黄嘌呤氧化酶的抑制率已经达到了98.5％以上，不仅超过了别嘌呤醇的抑制率，而且比传统的方法提取得到的异槲皮苷都具有更高的抑制率，说明本发明的方法制备得到的异槲皮苷(组分ae-3-7)的活性更强，对黄嘌呤氧化酶的抑制性更高。

技术特征：

1.一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷的制备方法，其特征在于，第(1)步中，浸提是用乙酸乙酯浸泡，并用超声辅助加速浸提，超声频率是20-50khz，重复浸提3次。

3.根据权利要求1所述的一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷的制备方法，其特征在于，第(2)步中，溶解使用的是质量分数为50％的甲醇水溶液，分离纯化使用的是中低压反相c18柱，过柱流速设置30ml/min，洗脱使用的是质量分数为30％的甲醇水溶液，收集的组分为第38～63min的组分。

4.根据权利要求1所述的一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷的制备方法，其特征在于，第(3)步中，溶解是使用纯甲醇溶解，分离纯化是使用sephadexlh-20，流速设置为0.25ml/min，洗脱剂为甲醇，收集组分是收集第1635～1770min组分。

5.根据权利要求1所述的一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷的制备方法，其特征在于，第(4)步中，酶活性抑制实验的过程包括：

6.根据权利要求1所述的一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷的制备方法，其特征在于，第(4)步中，异槲皮苷抑制黄嘌呤氧化酶的ic50值为101.12±1.66μg/ml。

7.一种权利要求1所述的抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷，其特征在于，该异槲皮苷为黄酮类化合物，具有c21h20o12分子式，化学结构如下：

8.一种权利要求7所述的一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷在制备降尿酸血症功能性食品方面的应用。

技术总结
本发明涉及一种抑制黄嘌呤氧化酶活性的异槲皮苷的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以陈皮作为原料，经过有机液浸提后，合并浸提液，旋转蒸发仪抽干溶剂，得到有机层提取物AE；(2)将有机层提取物AE过柱分离纯化，为组分AE‑3；(3)将组分AE‑3再次分离纯化，为组分AE‑3‑7；将组分AE‑3‑7经核磁鉴定为含有异槲皮苷；(4)进行酶活性抑制实验。本发明制备过程简单易操作；所得的异槲皮苷从陈皮中提取、分离纯化得到，并发现具有抑制黄嘌呤氧化酶活性，可制成降尿酸功能性食品，为降高尿酸血症的防治提供了新的来源，对于药食同源的中药材天然产物有效成分的研究具有十分重要的意义。

技术研发人员：林嘉珣
受保护的技术使用者：大洲新燕（厦门）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15