一种腺相关病毒突变体及其应用的制作方法

本发明涉及生物医药，具体涉及一种具有肝脏靶向性的腺相关病毒突变体及其应用。

背景技术：

1、腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)是一类包裹着线性单链dna基因组的无包膜小病毒，属于微小病毒科(parvoviridae)依赖病毒属(dependovirus)，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。aav基因组为单链dna片段，包含于非包膜病毒衣壳中，可分成三个功能区域：两个开放阅读框(rep基因、cap基因)和末端反向重复序列(itr)。重组腺相关病毒载体(raav)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其具有宿主范围广、非致病性、低免疫原性、长期稳定表达外源基因、良好的扩散性能和物理性质稳定等优点，作为基因转移载体在基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。在医学研究中，raav被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)，如基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

2、遗传疾病血友病是由于缺乏关键的凝血因子导致的疾病，患者出血后需要极长的时间来凝血，一些轻微的受伤，就可能带来足以威胁生命的影响。病情严重的患者的关节和肌肉还会经常自发出血。由于血友病是十分典型的单基因突变引起的罕见病，所以基因疗法对其治疗效果较为明显。已批准的b型血友病一次性基因疗法hemgenix为一种基于腺相关病毒5(aav5)的基因疗法，用于治疗目前正在使用凝血因子ix预防性治疗、目前或先前有发生危及生命的出血、或反复出现严重自发性出血发作的b型血友病(先天性因子ix缺乏症)成人患者。hemgenix由携带凝血因子ix基因的aav5病毒载体组成。该载体将因子ix的padua基因变体(fix padua)携带到肝脏的靶细胞中，hemgenix在提高b型血友病患者的平均因子ix活性和止血保护方面是独特的：一次性输注后数年，通过使机体持续产生因子ix，提高和维持血液中因子ix水平，减少每年出血发生率，减少或消除预防性治疗的需求。然而，hemgenix仍存在一定的问题，例如其需要较高的剂量，其推荐剂量为每千克(kg)体重2×1013个基因组拷贝(gc)，治疗价格高昂；hemgenix常见的副作用较大，例如肝酶升高等肝毒性的风险；预存抗体与aav相互作用影响治疗效果。此外，aav的免疫原性是限制治疗效果并引起副作用的重要原因之一，较高的剂量需求又进一步加剧免疫原性等问题，除了影响疗效，还会导致载体诱导的肝细胞损伤等问题。

3、虽然aav是目前应用广泛且最安全的基因治疗载体之一，但在肝脏内的长期表达、更低剂量、更低免疫原性等方面仍需进一步改进。因此，开发出具有更好治疗效果、降低治疗剂量、减少副作用和使用成本的血清型类型的aav载体，以筛选新的肝脏靶向aav血清型成为了一个必要的且具有重要临床价值的研究方向。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种腺相关病毒突变体及其应用。该腺相关病毒突变体具有特异的肝脏靶向性，具有剂量低、感染力强、安全性好的优点。

2、为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种腺相关病毒衣壳蛋白突变体，所述腺相关病毒衣壳蛋白突变体插入有异源肽；所述异源肽的氨基酸序列为如seq id no.1～4中任一所示的序列。

4、本发明的腺相关病毒衣壳蛋白突变体对肝脏的靶向能力有大幅提升，达到了野生型腺相关病毒的16倍以上；且缺乏对大脑的嗜性，具有相对的特异性，可避免感染脑部引起不必要副作用。

5、作为本发明所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体的优选实施方式，所述异源肽的插入位点位于腺相关病毒衣壳蛋白氨基酸588和589之间。

6、作为本发明所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体的优选实施方式，其氨基酸序列为如seq id no.9～12中任一所示的序列。

7、第二方面，本发明提供了一种编码腺相关病毒衣壳蛋白突变体的核酸，其核苷酸序列包含如seq id no.5～8所示的异源肽核苷酸序列。

8、作为本发明所述的编码腺相关病毒衣壳蛋白突变体的核酸的优选实施方式，其核苷酸序列为如seq id no.13～seq id no.16中任一所示的序列。

9、第三方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒，包括所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体。

10、本发明的重组腺相关病毒载体对肝脏具有特异的靶向性，对大脑的靶向性明显降低，是特异性良好的血清型突变体，将为临床使用，为广大疾病患者提供更好的肝脏疾病的基因治疗载体工具。而且还具有剂量低、感染力强、安全性好的优点。

11、作为本发明所述的重组腺相关病毒的优选实施方式，还包括异源目的基因。

12、作为本发明所述的重组腺相关病毒的优选实施方式，所述异源目的基因编码干扰rna、适配体、内切核酸酶、指导rna中任一种基因产物。

13、第四方面，本发明将所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体、所述的重组腺相关病毒在制备用于将基因产物递送至受试者细胞或组织中的药物或制剂中应用。

14、第五方面，本发明将所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体、所述的重组腺相关病毒在制备用于预防和/或治疗肝脏类疾病的药物递送工具中应用。

15、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

16、本发明基于临床应用广泛的aav9的基础上进行血清型筛选进化，开发一种剂量需求和费用更低的新型aav基因治疗产品，本发明的腺相关病毒衣壳蛋白突变体对肝脏的靶向能力有大幅提升，达到了野生型腺相关病毒的16倍以上；且缺乏对大脑的嗜性，具有相对的特异性，可避免感染脑部引起不必要副作用。本发明的重组腺相关病毒载体是特异性良好的血清型突变体，将为临床使用，为广大疾病患者提供更好的肝脏疾病的基因治疗载体工具。而且还具有剂量低、感染力强、安全性好的优点。本发明可满足更多不同患者的需求，推动基于aav的基因治疗方法朝向规模化、社会化应用，对于提升基因治疗的效益，服务于广大患者具有重要意义。

技术特征：

1.一种腺相关病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳蛋白突变体插入有异源肽；所述异源肽的氨基酸序列为如seq id no.1～4中任一所示的序列。

2.根据权利要求1所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，所述异源肽的插入位点位于腺相关病毒衣壳蛋白氨基酸588和589之间。

3.根据权利要求1所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体，其特征在于，其氨基酸序列为如seq id no.9～12中任一所示的序列。

4.一种编码腺相关病毒衣壳蛋白突变体的核酸，其特征在于，其核苷酸序列包含如seqid no.5～8所示的异源肽核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的编码腺相关病毒衣壳蛋白突变体的核酸，其特征在于，其核苷酸序列为如seq id no.13～seq id no.16中任一所示的序列。

6.一种重组腺相关病毒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体。

7.根据权利要求6所述的重组腺相关病毒，其特征在于，还包括异源目的基因。

8.根据权利要求7所述的重组腺相关病毒，其特征在于，所述异源目的基因编码干扰rna、适配体、内切核酸酶、指导rna中任一种基因产物。

9.权利要求1～3任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体、权利要求6～8任一项所述的重组腺相关病毒在制备用于将基因产物递送至受试者细胞或组织中的药物或制剂中的应用。

10.权利要求1～3任一项所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体、权利要求6～8任一项所述的重组腺相关病毒在制备用于预防和/或治疗肝脏类疾病的药物递送工具中的应用。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，公开了一种腺相关病毒突变体及其应用。本发明的腺相关病毒衣壳蛋白突变体插入有异源肽；异源肽的氨基酸序列为如SEQ IDNo.1～4中任一所示的序列。本发明的重组腺相关病毒包括所述的腺相关病毒衣壳蛋白突变体。本发明将所述腺相关病毒衣壳蛋白突变体、所述重组腺相关病毒在制备用于将基因产物递送至受试者细胞或组织中的药物或制剂、在制备用于预防和/或治疗肝脏类疾病的药物递送工具中应用。本发明的腺相关病毒衣壳蛋白突变体具有特异性的肝脏靶向性，为临床治疗提供更好的肝脏疾病的基因治疗载体工具。

技术研发人员：李华鹏,卜晔,钟育健,张有为,代志勇,潘越,陈欢
受保护的技术使用者：广州派真生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15