一种新型氟尼辛半抗原的制备方法及应用与流程

本发明涉及化学，特别涉及一种新型氟尼辛半抗原的制备方法及应用。

背景技术：

1、氟尼辛是一种动物专用的非甾体类抗炎药物，常与稳定剂葡甲胺以等比例形式出现形成稳定的氟尼辛葡甲胺盐。其药理作用机制主要是通过抑制环氧化酶来减少前列腺素等炎性介质的生成而发挥解热、镇痛和抗炎作用。临床上常用于各种疾病感染导致的猪、牛、马等大型动物的急性炎症；另外，其与抗生素联合用药，具有显著的药物协同作用，能够有效改善疾病的临床症状，自20世纪90年代研制成功以来，氟尼辛葡甲胺已在包括中国在内的多个国家得到广泛应用，并成为国内外兽医临床使用量最大的非甾体类抗炎药物。

2、目前，我国行业标准中对动物源性食品中氟尼辛的残留检测主要采用液相色谱-质谱/质谱法。此方法虽然特异性强、灵敏度高，但是样品前处理复杂繁琐，检测时间长，成本也较高，推广使用受到限制。免疫分析方法是一种基于抗原与抗体特异性反应的定性定量分析方法，该方法特异性强、灵敏度高，反应快速，操作简单，适合现场大量样本的实时检测。

3、在涉及到氟尼辛人工抗原和抗体制备的有限研究中，一是用游离的氟尼辛做为半抗原，另外就是用其代谢物5-羟基氟尼辛做为半抗原；两者自身带有羧基，不用改造就可以和蛋白进行偶联。但两者免疫出来的抗体，不能同时识别氟尼辛和5-羟基氟尼辛或交叉反应率较低。

4、针对以上问题，对现有装置进行了改进，提出了一种新型氟尼辛半抗原的制备方法及应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种新型氟尼辛半抗原的制备方法及应用，为了检测食品中氟尼辛的残留总量，针对氟尼辛和5-羟基氟尼辛，从头合成了一种保留两者完全结构同时又带有芳香氨基的半抗原，进一步偶联不同载体蛋白分别作为人工免疫原和包被原，进而制备氟尼辛检测抗体，其具有灵敏度高，特异性好，对氟尼辛和5-羟基氟尼辛能同时识别等显著优势，可用于快速检测动物食品中残留的氟尼辛及其代谢物。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种新型氟尼辛半抗原的制备方法，包括以下步骤：

3、s1：取2-氯-5-硝基烟酸2.1g（10mmol），2-甲基-3-三氟甲基苯胺2.6g（15mmol），加入20ml的dmf搅拌溶解；然后加入氢氧化钠0.8g（20mmol），升温至60℃反应6～8小时，降至室温，加入50ml的冰水，用乙酸乙酯进行萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，旋干乙酸乙酯，得5-硝基氟尼辛粗品，经乙醇重结晶得纯品；

4、s2：称取1.7g4硝基氟尼辛（5mmol），装入容积为250ml三口圆底烧瓶底部，随后向瓶底边搅拌边加入100ml，待4硝基氟尼辛被苯溶解后再加入2.6g(40mmol)纯锌粉，搅拌均匀后分次加入8ml浓hcl，室温搅拌30min后再次加入2.6g(40mmol)纯锌粉，室温搅拌反应8h，薄板层析法(tlc)监测反应直至反应完全；

5、s3：反应结束后，将100ml冷水加入反应体系，并用2mnaoh溶液中和至弱酸性(ph=6-7）；

6、s4：静置1h后分离并保留苯层，再用苯萃取水层，合并萃取液，有机相经水洗后用无水硫酸钠脱水干燥以除去多余的水分，有机相减压蒸馏以除去苯，得到的粗品再用硅胶柱层析纯化后得到淡黄色固体5-氨基氟尼辛半抗原。

7、进一步地，氟尼辛完全抗原（氟尼辛人工抗原）为所述半抗原中芳氨基与所述载体蛋白中的酪氨酸或组氨酸残基反应发生化学反应形成重氮键连接的偶联物，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白和卵清白蛋白中的至少一种。

8、一种新型氟尼辛完全抗原的制备方法，包括以下步骤：

9、s01：半抗原5-氨基氟尼辛的合成；

10、s02：半抗原活化酯的合成；

11、s03：人工抗原的合成。

12、进一步地，s02包括以下步骤：

13、s021：在5ml的玻璃瓶中，取5-氨基氟尼辛30mg，用1ml的n，n-二甲基甲酰胺溶解配制成a液；

14、s022：分别称取1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐20mg，n-羟基丁二酰亚胺12mg，两者混合一起用0.5ml的n，n-二甲基甲酰胺溶解配制成b液；

15、s023：常温条件下b液逐滴加入a液中，然后室温搅拌过夜，终止反应后即得半抗原活化酯。

16、进一步地，s03包括以下步骤：

17、s031：取半抗原活化酯4mg，加入到溶有5mg血蓝蛋白的pbs（0.01mol/l，ph=7.4）溶液中，于4度条件下反应过夜；

18、s032：然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/lpbs溶液充分透析，得到人工抗原（免疫原）；

19、s033：取半抗原活化酯25mg，加入到溶有100mgbsa的pbs（0.01mol/l，ph=7.4）溶液中，于4度条件下反应过夜；

20、s034：然后将反应液装入透析袋，用0.01mol/lpbs溶液充分透析，得到人工抗原（包被原）。

21、一种新型氟尼辛半抗原的应用，利用新型氟尼辛半抗原制备抗体的制备方法，包括以下步骤：

22、s001：选取适龄雌性balb/c小鼠进行免疫，第4次免疫和第5次免疫后测定抗血清的效价和抑制率，在细胞融合前3天加强免疫；

23、s002：取加强免疫后的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，扩大培养；

24、s003：将扩大培养的杂交瘤细胞注入已提前注射石蜡的小鼠体内，收集腹水，得到单克隆抗体。

25、进一步地，由此半抗原制备的单克隆抗体，可以特异性识别氟尼辛和及其代谢物5-羟基氟尼辛，该半抗原最大限度保留了两者共同的化学结构，以该半抗原为基础，与载体蛋白偶联，用于免疫小鼠制备抗体，并以抗原抗体为基础开发了试剂盒产品。

26、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

27、本发明提出的一种新型氟尼辛半抗原的制备方法及应用，设计合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，从而定性定量的检测样本中超微量小分子目标物，可用于样本测定，通过此半抗原制备的单克隆抗体，可以特异性识别氟尼辛和及其代谢物5-羟基氟尼辛，该半抗原最大限度保留了两者共同的化学结构，提高了半抗原的特异性和灵敏度，又为抗原制备加入了反应位点。经过柱净化浓缩，以该半抗原为基础，与载体蛋白偶联，用于免疫小鼠制备抗体，并以抗原抗体为基础开发了试剂盒产品，为氟尼辛在食品中的残留检测提供了高效和可靠的检测方法。

技术特征：

1.一种新型氟尼辛半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种新型氟尼辛半抗原的制备方法，其特征在于，氟尼辛完全抗原（氟尼辛人工抗原）为所述半抗原中芳氨基与所述载体蛋白中的酪氨酸或组氨酸残基反应发生化学反应形成重氮键连接的偶联物，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血蓝蛋白和卵清白蛋白中的至少一种。

3.如权利要求2所述的一种新型氟尼辛完全抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的一种新型氟尼辛完全抗原的制备方法，其特征在于，s02包括以下步骤：

5.如权利要求3所述的一种新型氟尼辛完全抗原的制备方法，其特征在于，s03包括以下步骤：

6.一种新型氟尼辛半抗原的的应用，其特征在于，利用新型氟尼辛半抗原制备抗体的制备方法，包括以下步骤：

7.如权利要求6所述的一种新型氟尼辛半抗原的的应用，其特征在于：由此半抗原制备的单克隆抗体，可以特异性识别氟尼辛和及其代谢物5-羟基氟尼辛，该半抗原最大限度保留了两者共同的化学结构，以该半抗原为基础，与载体蛋白偶联，用于免疫小鼠制备抗体，并以抗原抗体为基础开发了试剂盒产品。

技术总结
本发明公开了一种新型氟尼辛半抗原的制备方法及应用，涉及化学技术领域，设计合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，从而定性定量的检测样本中超微量小分子目标物，可用于样本测定，通过此半抗原制备的单克隆抗体，可以特异性识别氟尼辛和及其代谢物5‑羟基氟尼辛，该半抗原最大限度保留了两者共同的化学结构，提高了半抗原的特异性和灵敏度，又为抗原制备加入了反应位点。

技术研发人员：朱永利,蒋永青,黄斌,张金超,张吉,常文伟
受保护的技术使用者：深圳市绿诗源生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15