一种胶原结合型的外泌体、外泌体冻干粉及制备方法

本发明涉及外泌体制备制备，具体涉及一种胶原结合型的外泌体、外泌体冻干粉及制备方法。

背景技术：

1、外泌体是一类由细胞主动分泌的脂质双分子层结构囊泡，外泌体中包含大量因子、rna和dna等物质，参与细胞间的信息交流，对细胞间的相互作用起到重要桥梁作用，因而应用较为广泛。然而现有外泌体在应用仍然存在靶向性不佳的问题，因此如何使干细胞分泌的外泌体在局部靶向稳定发挥作用至关重要，近年来，随着生物技术的发展，通过基因编辑方式修饰干细胞，并使分泌的外泌体包含目的分子是研究的热点，如公开号为cn115093459a的中国专利公开了一种可在外泌体表面进行轴突靶向修饰的递送复合物及其对外泌体的修饰方法，其靶向轴突的外泌体具有良好的血液稳定性、隐身性、靶向性，可有效识别中枢神经系统轴突组织。公开号为cn115177742a的中国专利公开了一种载药脑靶向外泌体的制备方法及其应用，其外泌体来源于小鼠单核巨噬细胞白血病细胞的细胞上清，所述的脑靶向外泌体载药体系能够将药物负载至外泌体内，且无明显生物毒性作用，尾静脉少量给药即可透过血脑屏障进入中枢实现抑制血管紧张素(ras)的表达。

2、外泌体在促进伤口愈合方面具有较大潜力，可应用于损伤，在动物模型中已被证明可以促进胶原蛋白的合成以及成纤维细胞和角质形成细胞的增殖和迁移。现有新技术中，外泌体在损伤上的应用不断在研究和改进，如将外泌体掺入凝胶后应用于损伤，由于外泌体递送速率缓慢而稳定，从而比外泌体单次直接给药更为有益。然而外泌体在损伤应用上，同样存在缺乏靶向性、外泌体局部逸散而导致疗效降低的问题，因此，开发一种可靶向结合损伤部位的外泌体对提高外泌体疗效、使外泌体更好的应用于损伤治疗具有很好的研究价值和应用前景。

3、此外，现有的外泌体在保存与使用过程中，常用的方式为将流动的液态外泌体在-80℃的条件下保存，冷冻保存液中采用二甲基亚砜/甘油进行保护，储存成本较高且不便。并且使用二甲基亚砜/甘油与外泌体制备的混合物容易对机体细胞造成刺激损伤，降低外泌体的生物疗效。因此，本发明旨在开发一种胶原结合型的外泌体及胶原结合型外泌体冻干粉的制备方法，以制备得到一种能在常温下保存、运输且有效保留活性的胶原结合型外泌体冻干粉。

技术实现思路

1、本发明所解决的技术问题在于提供一种外泌体，以解决现有技术中干细胞来源的外泌体缺乏靶向性，局部损伤应用过程中容易逸散、疗效不佳的问题。

2、本发明所解决的技术问题之二在于提供一种外泌体冻干粉，解决现有技术中外泌体缺乏靶向性、疗效不佳，且在保存过程中容易损坏和降解失活的问题。

3、本发明所解决的技术问题之三在于提供所述的外泌体冻干粉的制备方法。

4、本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

5、一种胶原结合型的外泌体，外泌体的制备方法包括：

6、构建重组表达载体phblv-cmv-cd63-ef1-zsgreen-t2a-puro，重组表达载体的核苷酸序列包括如seq id no:1所示；

7、将重组表达载体转染干细胞，使干细胞分泌出具有胶原结合特性的外泌体。

8、进一步地，所述干细胞优选为人脂肪间充质干细胞或人骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞或人脲原性干细胞。本发明的技术方案中，包括但不限于上述优选的干细胞，也可以采用其它的人体干细胞。

9、进一步地，所述重组表达载体采用慢病毒转染的方式进行转染，慢病毒转染的实施步骤包括：

10、将不含内毒素的所述重组表达载体转染至淋巴细胞，培养后收集细胞液得到病毒液；

11、将病毒液与培养后的干细胞混合，将感染成功的干细胞培养至60～70％用于外泌体的提取。

12、一种外泌体冻干粉，采用如上所述的外泌体为原料、冻干保护剂为辅料制备而成，所述冻干保护剂包括30-40g/l海藻糖、2.0-3.0mm硫酸锰、0.01-0.015mol/l磷酸盐缓冲液，冻干保护剂的ph值为7.35～7.45。

13、进一步地，所述外泌体与冻干保护剂的质量比为1:1。

14、进一步地，所述外泌体为外泌体浓缩液，外泌体浓缩液的浓度为400～600ug/ml。

15、进一步地，所述冻干保护剂包括35g/l海藻糖、2.5mm硫酸锰、0.012mol/l磷酸盐缓冲液，冻干保护剂的ph值为7.4。

16、所述的外泌体冻干粉的制备方法，将外泌体与干细胞混合，过滤后置于液氮中速冻，速冻5～10min后转移至真空冷冻干燥机中冷冻干燥得到外泌体冻干粉。

17、有益效果：本发明所述的外泌体，其采用基因编辑技术构建独特的慢病毒载体，并转染干细胞，从而使干细胞分泌出具有胶原结合特性的外泌体，所述的外泌体能靶向地与损伤处的胶原结合，从而更为稳定的发挥作用。

18、本发明所述的外泌体冻干粉，有效保留活性，可靶向结合于损伤部位，有效促进局部细胞增殖和血管生成，且可常温长期保存和运输，可广泛方便使用于多种损伤修复，使用方便，用途广泛。

19、本发明所述的外泌体冻干粉制备方法，其采用的冻干保护剂可为外泌体提供稳定存在的微环境，又可以在使用过程中辅助外泌体功能，有效促进局部损伤的血管再生，同时外泌体冻干保护剂呈现弱碱性，可中和损伤局部的弱酸性环境，使损伤局部ph趋向于贴合机体细胞适宜生长增殖的ph值；采用独特的冻干保护剂结合液氮速冻预处理技术，替代了传统外泌体保存液中常用的甘油和二甲亚砜防冰晶形成作用，以及胎牛血清白蛋白对外泌体的蛋白保护作用，避免外泌体冻干粉在使用过程中对机体的刺激和异种蛋白引起的免疫反应，并能通过冻干保护剂形成独特的保护膜，在冻干保护剂各成分的协同作用下减少低温和干燥过程中外泌体的损伤，使外泌体生物膜保持完整，很好的维持外泌体中生物分子的活性。

技术特征：

1.一种胶原结合型的外泌体，其特征在于，外泌体的制备方法包括：

2.根据权利要求1所述的胶原结合型的外泌体，其特征在于，所述干细胞包括人脂肪间充质干细胞或人骨髓间充质干细胞或人脐带间充质干细胞或人脲原性干细胞。

3.根据权利要求1所述的胶原结合型的外泌体，其特征在于，所述重组表达载体采用慢病毒转染的方式进行转染，慢病毒转染的实施步骤包括：

4.一种外泌体冻干粉，其特征在于，采用如权利要求1～3任一所述的外泌体为原料、冻干保护剂为辅料制备而成，所述冻干保护剂包括30-40g/l海藻糖、2.0-3.0mm硫酸锰、0.01-0.015mol/l磷酸盐缓冲液，冻干保护剂的ph值为7.35～7.45。

5.根据权利要求4所述的外泌体冻干粉，其特征在于，所述外泌体与冻干保护剂的质量比为1:1。

6.根据权利要求4所述的外泌体冻干粉，其特征在于，所述外泌体为外泌体浓缩液，外泌体浓缩液的浓度为400～600ug/ml。

7.根据权利要求4所述的外泌体冻干粉，其特征在于，所述冻干保护剂包括35g/l海藻糖、2.5mm硫酸锰、0.012mol/l磷酸盐缓冲液，冻干保护剂的ph值为7.4。

8.如权利要求4所述的外泌体冻干粉的制备方法，其特征在于，将外泌体与干细胞混合，过滤后置于液氮中速冻，速冻5～10min后转移至真空冷冻干燥机中冷冻干燥得到外泌体冻干粉。

技术总结
本发明涉及外泌体制备技术领域，具体公开了一种胶原结合型的外泌体，外泌体的制备方法包括：构建重组表达载体pHBLV‑CMV‑CD63‑EF1‑ZsGreen‑T2A‑puro，重组表达载体的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示；将重组表达载体转染干细胞，使干细胞分泌出具有胶原结合特性的外泌体。本发明制备得到的外泌体能很好地靶向损伤处的胶原，从而能更稳定的发挥作用。本发明还公开了外泌体冻干粉，可常温长期保存和运输，且可有效保留活性，能广泛方便使用于多种损伤修复，使用方便，用途广泛。

技术研发人员：吕红斌,石新,许琰,胡建中
受保护的技术使用者：中南大学湘雅医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15