一种羰基还原酶及其突变体及其在制备手性(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯中的应用的制作方法

本发明涉及酶的基因工程，尤其涉及一种羰基还原酶及其突变体及其在制备手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯中的应用。

背景技术：

1、α-硫辛酸(分子式c8h14o2s2，分子量206.33，cas号：1200-22-2)属于维生素类药物，是一种兼具脂溶性与水溶性的万能抗氧剂。主要用于治疗糖尿病，急性肝炎，脂肪肝等肝病。硫辛酸的生理活性仅限于右旋硫辛酸即(r)-α-硫辛酸，而(s)-α-硫辛酸基本没有生理活性。

2、目前工业制备(r)-α-硫辛酸主要以化学拆分为主，以8-氯-6-羟基辛酸乙酯和手性助剂(r)-α-甲基苄胺为原料，通过多次重结晶、酸化水解，最终得到(r)-α-硫辛酸。或以8-氯-6-羟基辛酸乙酯和手性助剂(s)-α-甲基苄胺为原料，重结晶、水解、酯化后得到(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯，该产物在氯化亚砜、吡啶和甲苯作用下生成(r)-6,8-二氯辛酸酯，然后用二硫化钠进行取代，再用有机酸进行水解反应，生成最终产品(r)-α-硫辛酸。但上述方法存在用于拆分反应的手性助剂价格昂贵、收率低的问题。

3、相较于化学合成法，生物催化法具有反应条件温和、环境友好、立体选择性强等优点。目前生物法制备(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯主要采用醇脱氢酶和羰基还原酶。专利us7157253b2报道了利用来自thermoanaerobium brokii的醇脱氢酶tbadh催化8-氯-6-氧代辛酸乙酯还原转化生成产物(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯，光学纯度可达99.5％，但其转化率仅85％，而且反应体系中还需要添加0.5mm辅酶和1mm二硫苏糖醇(dtt)。专利w02005049816a2报道了用一种来自metschnikowia zobellii的氧化还原酶，可将底物转化为产物(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯，其ee值可达97％，但反应体系中需添加0.1mm的辅酶，反应24小时后的转化率仅为55％。现有的(r)-α-硫辛酸合成方法难以满足对光学纯(r)-α-硫辛酸不断增加的市场需求，故仍需要进一步拓展(r)-α-硫辛酸的合成方法。

技术实现思路

1、本发明首先为了克服现有技术下生物催化法制备手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯反应速率慢，生产效率低的问题，提供一种羰基还原酶及其突变体，该羰基还原酶和其突变体具有良好的底物耐受性和催化活性，可提高反应效率。本发明还提供了一种手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的制备方法，该方法反应条件温和对环境友好，且制备效率高，产物纯度高。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种羰基还原酶，所述羰基还原酶为羰基还原酶cat，其氨基酸序列如seq idno.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明羰基还原酶来源于茶假丝酵母菌(candida theae)，可用于高效催化6-羰基-8-氯辛酸酯的不对称还原，生成光学纯(r)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯。

5、作为优选，所述突变体的氨基酸序列为由如seq id no.1所示氨基酸序列经突变得到，突变包括下述至少一个突变位点：126位、129位、194位。

6、本发明的羰基还原酶突变体与羰基还原酶野生型相比具有更优的催化活性。

7、作为优选，所述突变为下述突变位点中一个或几个的组合：126位丝氨酸突变为丙氨酸、129位精氨酸突变为谷氨酰胺、129位精氨酸突变为丙氨酸、129位精氨酸突变为亮氨酸、129位精氨酸突变为半胱氨酸、194位缬氨酸突变为丙氨酸、194位缬氨酸突变为半胱氨酸。

8、一种编码基因，所述编码基因为上述羰基还原酶或突变体的编码基因。

9、一种含有上述编码基因的重组表达载体。

10、一种工程菌，所述工程菌通过上述重组表达载体转化至宿主细菌中获得。

11、一种手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的制备方法，以8-氯-6-氧代辛酸乙酯为底物，将上述的羰基还原酶或上述的突变体与脱氢酶、nadp+、葡萄糖加入反应溶剂中得到转化体系，反应得到手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯。

12、本发明使用上述羰基还原酶及其突变体催化8-氯-6-氧代辛酸乙酯的不对称还原反应，底物浓度高、转化率高，底物浓度达1mol/l(或220g/l)，转化率可达96％，产物ee值高于99％。相对于其他(r)-α-硫辛酸合成前体的不对称还原制备方法，本发明具有反应时间短和光学纯度高的优势，有利于实现(r)-α-硫辛酸的高效、低成本生产，具有工业化应用前景。

13、作为优选，所述羰基还原酶或突变体以上述工程菌诱导培养后的湿菌体形式加入。

14、作为优选，所述湿菌体由将工程菌在37℃下培养至od600为2.5-3.5，加入0.05-1.0mmol/l异丙基-p-d-硫代啦喃半乳糖16-25℃下诱导12-24h后离心得到。

15、作为优选，所述反应溶剂为缓冲液及有机共溶剂的混合液，缓冲液为tris-hcl缓冲液、磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液，缓冲液的浓度范围为10-200mm，ph为6.0-7.5；所述有机共溶剂为乙醇、异丙醇、甲醇中的一种或多种，缓冲液与有机共溶剂的体积比为(900-950)：(50-100)。

16、作为优选，所述转化体系中底物初始浓度为200-220g/l，羰基还原酶或突变体的用量以湿菌体计为100-120g/l，羰基还原酶或突变体与脱氢酶的添加比例为(1-2)：1，nadp+的质量分数为8％-10％，葡萄糖与底物的摩尔比为(0.8-1.8)：1。

17、作为优选，所述制备方法还包括转化体系反应后对产物纯化得到高化学纯和光学纯的手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯，纯化过程包括使用等量水不溶性有机溶剂进行萃取，向萃取液加入无水硫酸钠干燥后除去溶剂后，再溶解后经减压蒸馏即可得产物；水不溶性有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醚和甲基叔丁基醚中的一种或几种。

18、因此，本发明具有如下有益效果：(1)提供了一种可应用于催化潜手性羰基化合物的不对称还原反应的羰基还原酶及其突变体；(2)应用于催化酯化合成(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯反应时，具有催化反应底物浓度高、反应速率快、产品光学纯度高等优点，有利于实现(r)-α-硫辛酸的高效、低成本生产，具有工业化应用前景。

技术特征：

1.一种羰基还原酶，其特征是，所述羰基还原酶为羰基还原酶cat，其氨基酸序列如seqid no.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示。

2.如权利要求1所述的羰基还原酶的突变体，其特征是，所述突变体的氨基酸序列为由如seq id no.1所示氨基酸序列经突变得到，突变包括下述至少一个突变位点：126位、129位、194位。

3.根据权利要求2所述的突变体，其特征是，所述突变为下述突变位点中一个或几个的组合：126位丝氨酸突变为丙氨酸、129位精氨酸突变为谷氨酰胺、129位精氨酸突变为丙氨酸、129位精氨酸突变为亮氨酸、129位精氨酸突变为半胱氨酸、194位缬氨酸突变为丙氨酸、194位缬氨酸突变为半胱氨酸。

4.一种编码基因，其特征是，所述编码基因为如权利要求1所述的羰基还原酶或如权利要求2或3所述的突变体的编码基因。

5.一种含有如权利要求4所述的编码基因的重组表达载体。

6.一种工程菌，其特征是，所述工程菌通过如权利要求5所述的重组表达载体转化至宿主细菌中获得。

7.一种手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的制备方法，其特征是，以8-氯-6-氧代辛酸乙酯为底物，将如权利要求1所述的羰基还原酶或如权利要求2或3所述的突变体与脱氢酶、nadp+、葡萄糖加入反应溶剂中得到转化体系，反应得到手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯。

8.根据权利要求7所述的一种手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的制备方法，其特征是，所述羰基还原酶或突变体以如权利要求6所述的工程菌诱导培养后的湿菌体形式加入。

9.根据权利要求8所述的一种手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的制备方法，其特征是，所述反应溶剂为缓冲液及有机共溶剂的混合液，缓冲液为tris-hcl缓冲液、磷酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液，缓冲液的浓度范围为10-200 mm，ph为 6.0-7.5；所述有机共溶剂为乙醇、异丙醇、甲醇中的一种或多种，缓冲液与有机共溶剂的体积比为（900-950）：（50-100）。

10.根据权利要求8或9所述的一种手性(r)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的制备方法，其特征是，所述转化体系中底物初始浓度为200-220g/l，羰基还原酶或突变体的用量以湿菌体计为100-120g/l，羰基还原酶或突变体与脱氢酶的添加比例为（1-2）：1，nadp+ 的质量分数为8%-10%，葡萄糖与底物的摩尔比为（0.8-1.8）：1。

技术总结
本发明涉及酶的基因工程技术领域，为解决现有技术下生物催化法制备手性(R)‑8‑氯‑6‑羟基辛酸乙酯反应速率慢，生产效率低的问题，提供一种羰基还原酶及其突变体及其在制备手性(R)‑8‑氯‑6‑羟基辛酸乙酯中的应用，所述羰基还原酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变体的氨基酸序列为由如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经突变得到，突变包括下述至少一个突变位点：126位、129位、194位。该该羰基还原酶和其突变体具有良好的底物耐受性和催化活性，可提高反应效率，可应用于催化潜手性羰基化合物的不对称还原反应。

技术研发人员：夏娜娜,魏婷,黄选,韩晓龙,张朋,陈航
受保护的技术使用者：杭州馨海酶源生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15