一种利用丁酸供能生长并生成酮体的绵羊瘤胃上皮细胞株

本发明涉及生物和现代农业，尤其涉及一种利用丁酸供能生长并生成酮体的绵羊瘤胃上皮细胞株及其构建方法、培养方法与应用。

背景技术：

1、瘤胃是反刍动物消化代谢和营养物质吸收的重要场所，瘤胃健康是反刍动物高效养殖的基础。研究其生长发育及生理功能具有重要意义，是反刍动物研究的热门内容。但在体试验具有价格昂贵、实验周期长等缺点，而体外培养的瘤胃上皮细胞具有培养环境可控、遗传背景相似和重复性好等优点。因此建立瘤胃上皮细胞系，可以为研究瘤胃上皮组织生长发育及生理功能提供有效模型，进而提高反刍动物生产效率，有着重要的生产和科学意义。

2、但现有的瘤胃上皮细胞模型存在以下两方面的缺陷：

3、首先，和哺乳动物不同，反刍动物瘤胃中大量存在挥发性脂肪酸，其中丁酸在瘤胃上皮细胞中大量代谢，用于直接向瘤胃上皮细胞供能，或用于生成酮体向其他器官供能。这一特殊的生理现象是瘤胃研究中的热点。现有的研究均显示，在体外培养的瘤胃上皮细胞中添加和瘤胃中生理浓度近似的丁酸，会导致细胞活性下降，细胞生长受到抑制。(高健.瘤胃上皮挥发性脂肪酸吸收与生物钟因子表达关系的研究[d].江苏:扬州大学,2017,23,表3-3.)(李文静.基于转录组学和代谢组学分析丁酸对奶牛瘤胃上皮细胞营养代谢的影响[d].河南:河南农业大学,2021,12,图3-5)(刘理想.口腔灌服丁酸钠对哺乳期羔羊瘤胃上皮发育的影响及机制研究[d].江苏:南京农业大学,2019,55，图4-2.)因此建立可以耐受瘤胃生理浓度丁酸的瘤胃上皮细胞系具有现实且急迫的需要，但目前尚没有这种细胞模型被建立。

4、第二，瘤胃上皮为复层扁平上皮，从腔内向腔外分为四层，依次为角质层、颗粒层、棘突层和基底层，每一层都有其独特的细胞形态与功能，现有方法直接消化瘤胃上皮，将解离出的混合细胞进行培养，其中混合了四层不同的细胞，严重限制了针对瘤胃上皮各层细胞功能的精确研究。棘突层细胞中含有大量的线粒体，是进行丁酸代谢的主要细胞类型，因此建立可以代表瘤胃中具有丁酸代谢能力的棘突层细胞的细胞株有着现实且急迫的需要，但目前尚没有这种单克隆细胞株被建立。

技术实现思路

1、发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明提供一种利用丁酸供能生长并生成酮体的绵羊瘤胃上皮细胞株及其构建方法、利用丁酸的培养方法，此细胞系可以用于瘤胃上皮细胞对丁酸吸收、代谢研究；瘤胃上皮细胞中酮体生成，代谢、转运研究；同时以此为模型筛选能促进反刍动物瘤胃生长发育、生酮等关键功能的天然植物饲料添加剂。

2、技术方案：本发明的一种利用丁酸供能生长并生成酮体的绵羊瘤胃上皮细胞株，其特征在于：该细胞株为绵羊瘤胃上皮细胞株05b7，于2023年4月19日宝藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c202392。

3、本发明的利用丁酸供能生长并生成酮体的绵羊瘤胃上皮细胞株的构建、培养、丁酸诱导生酮方法包括下述步骤：

4、1)以杨春蕾(cn201910137658.x)已公开的方法分离绵羊瘤胃上皮细胞并进行永生化，通过有限稀释法获得单克隆细胞；

5、2)对获得的单克隆细胞进行基因定量分析，筛选出高表达生酮基因的单克隆细胞系。本发明高表达生酮基因的单克隆为05b7，对其进行保藏；

6、3)对获得的单克隆细胞系进行生长性能、生酮能力鉴定。

7、所述的步骤1)具体包括下述步骤：

8、1)取新生绵羊的瘤胃上皮组织，剪碎清洗，利用胰蛋白酶进行消化，处理后得到原代绵羊瘤胃上皮细胞；将携带sv40t抗原基因的慢病毒液感染原代绵羊瘤胃上皮细胞，72小时后再用杀稻瘟菌素筛选，进一步培养得到永生化的绵羊瘤胃上皮细胞系；

9、2)以0.5细胞/孔的密度将永生化的绵羊瘤胃上皮细胞的单细胞接种于96孔板，培养至细胞在孔中完全汇合；

10、3)将每孔的细胞依次从96孔板，48孔板，24孔板，12孔板直至扩大培养至6孔板，6cm皿，10cm皿并保存。

11、所述的步骤2)具体包括下述步骤：

12、q-pcr挑选高表达生酮基因(bdh1)的细胞株，进一步扩大培养并保存。

13、所述的步骤3)具体包括下述步骤：

14、1)在dmem+10％fbs培养，外观呈铺路石状上皮细胞样；当细胞密度接近90％时使用37℃预热pbs洗涤培养皿，加入适量含edta的胰酶在37℃，5％co2培养箱消化3min，当在镜下观察到细胞质回缩，使用37℃预热生酮培养基1终止胰酶反应，将30％细胞传代于新的培养皿，使用生酮培养基1培养。

15、2)6小时后，更换生酮培养基2培养，可以观察到细胞迅速生长且形态发生变化。

16、所述的生酮培养基1的配方为：dmem无糖(no glucose no l-glutamine，nohepes，no sodium pyruvate)，10％fbs。

17、所述的生酮培养基2的配方为：dmem无糖(no glucose no l-glutamine，nohepes，no sodium pyruvate)，10％fbs，10mm sodium butyrate。

18、本发明细胞株在瘤胃上皮丁酸吸收、代谢机制研究中的应用。

19、本发明细胞株在瘤胃上皮酮体转运与代谢机制研究中的应用。

20、本发明细胞株在酮体调控瘤胃上皮vfa转运机制研究中的应用。

21、本发明细胞株在酮体调控瘤胃上皮发育过程中分子机制的应用。

22、本发明细胞株在筛选调控瘤胃关键生理功能的天然植物饲料添加剂中的应用。

23、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：本发明过发明人大量的创造性劳动，首次构建了可以利用丁酸供能、代谢并高表达生酮基因的绵羊瘤胃上皮单克隆细胞株：05b7；提出了可以促进体外培养的瘤胃上皮细胞生酮的方法。

技术特征：

1.一种利用丁酸供能生长并生成酮体的绵羊瘤胃上皮细胞株，其特征在于：该细胞株为绵羊瘤胃上皮细胞株05b7，于2023年4月19日宝藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:c202392。

2.根据权利要求1所述的细胞株的建构方法，其特征在于：包括下述步骤：

3.根据权利要求1所述的细胞株的培养方法，其特征在于：包括下述步骤：

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：所述的生酮培养基1的配方为：dmem无糖，10％fbs。

5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于：所述的生酮培养基2的配方为：dmem无糖，10％fbs，10mm sodium butyrate。

6.根据权利要求1所述的细胞株在瘤胃上皮丁酸吸收、代谢机制研究中的应用。

7.根据权利要求1所述的细胞株在瘤胃上皮酮体转运与代谢机制研究中的应用。

8.根据权利要求1所述细胞株在酮体调控瘤胃上皮vfa转运机制研究中的应用。

9.根据权利要求1所述的细胞株在酮体调控瘤胃上皮发育过程中的应用。

10.根据权利要求1所述的细胞株在筛选调控瘤胃关键生理功能的天然植物饲料添加剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种利用丁酸供能生长并生成酮体的绵羊瘤胃上皮细胞株，该细胞株为绵羊瘤胃上皮细胞株05B7，于2023年4月19日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202392。同时公开了该细胞株的构建方法、培养方法与应用。本发明的细胞株可以利用丁酸供能生长、代谢并高表达生酮基因，因此可以应用于绵羊瘤胃上皮对丁酸吸收代谢的相关研究，绵羊瘤胃上皮中酮体生成与代谢的相关研究，并可以此细胞株为模型筛选促进反刍动物瘤胃生长发育、生酮等关键功能的添加剂。

技术研发人员：黄赞,秦静,张雅丽,刘军花,毛胜勇
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15