蛋白激发子BLH1及其在提高植物抗病能力中的应用

本发明属于农业微生物学、生物化学及分子生物学领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)中稳定表达的蛋白激发子blh1及其在提高植物抗病能力中的应用。

背景技术：

1、目前，植物病害防控的主要措施是化学防治和抗病品种的选育。但是，化学药剂的使用常带来环境污染和食品安全问题；病原菌小种变异带来抗药性以及克服抗病基因等问题降低了防治效果；两种病害防控防治策略的效果受到严重影响，有待研发环保、广谱、持久、高效的病害防控策略。

2、在植物-微生物的长期互作过程中，植物已经进化出一系列复杂的防御机制来抵御微生物的侵害，感知这些微生物对植物来说非常重要。系统获得抗病性(systemicacquired resistance,sar)和诱导系统抗病性(induced systemic resistance,isr)是植物在感知致病性或非致病性微生物时产生的系统防御反应。其中，isr一般具有广谱性和非特异性，能够有效提高植物抵御病原微生物的能力。有益微生物能够使植物产生isr，植物通过感知这类有益微生物及其代谢产物，将信号传递到整株植株，进而引起植物一系列的生理生化反应，包括活性氧迸发、胼胝质沉积、病程相关蛋白的合成等，提高寄主植物对病害侵染的抵抗力，从而降低病害的发生率。

3、激发子是指所有能够被植物识别并激活植物免疫反应，提高植物对病虫害等抗性的物质，蛋白激发子是众多激发子中重要的一类。生防菌中的蛋白激发子在抗病虫害方面有较大的潜力可挖掘，但目前对蛋白质激发子的研究主要针对病原真菌或细菌，关于芽孢杆菌蛋白质激发子的研究相对较少。

4、本发明从地衣芽孢杆菌bl06的发酵上清液中分离并得到了一种新的蛋白激发子，对重组蛋白激发子功能进行进一步研究，探究其诱导植物抗性机制，揭示其激发植物防御反应的水平，本发明不仅为有益微生物在与植物互作过程中如何提高植物抗病性提供新的理论依据，而且为开发广谱高效环保的免疫性蛋白质生物农药提供有效的蛋白来源。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种蛋白激发子blh1。

2、本发明的第二目的在于提供前述蛋白激发子blh1的编码基因。

3、本发明的第三目的在于提供前述蛋白激发子blh1的应用。

4、为达到以上目的，本发明采取以下技术措施：

5、第一方面，本实验室根据地衣芽孢杆菌外泌蛋白能够被本氏烟草识别，诱发本氏烟草免疫反应的原理，收集地衣芽孢杆菌的液体培养液，并使用硫酸铵沉淀的方法提取粗蛋白，将提取粗蛋白使用capto deae阴离子交换树脂和superdex 75凝胶柱进行分离纯化，送公司进行质谱测序后，得到一个新型蛋白质激发子blh1。

6、使用ncbi数据库比对blh1蛋白的核苷酸序列，设计特异性引物克隆blh1基因，使用pet-32a载体对blh1进行原核表达并获得带有his标签的重组蛋白blh1-his，其氨基酸序列，编码如seq id no:2所示。

7、将序列表中的seq id no:2氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有激发子蛋白功能的由seq id no:2衍生的蛋白质也属于本发明的保护范围。

8、第二方面，本发明保护编码前文所述的蛋白激发子blh1的基因。

9、在具体的实施方案中，所述基因选自如下1)-3)所示的dna分子：

10、1)序列表中的seq id no:1所示的dna分子；

11、2)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交且编码所述蛋白激发子blh1的dna分子；

12、3)与1)或2)的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码合成相关蛋白激发子的dna分子。

13、第三方面，本发明还保护扩增所述基因blh1的全长或任一片段的引物对。

14、在具体的实施方案中，所述引物对如seq id no:3-4所示。

15、第四方面，本发明还保护含有前文所述基因blh1的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

16、第五方面，本发明还保护前文所述的蛋白激发子blh1和/或前文所述的基因和/或前文所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在如下(a1)-(a4)中的任一种应用：

17、(a1)在提高植物抗病能力中应用；

18、(a2)在制备提高植物抗病能力的药物中的应用；

19、(a3)诱导植物抗病中的应用；

20、(a4)在制备诱导植物抗病的药物中的应用。

21、在具体的实施方案中，所述植物为烟草或拟南芥。

22、在具体的实施方案中，病原菌为烟草花叶病毒或丁香假单胞菌。

23、在更具体的实施方案中，提高植物抗病能力主要包括减弱烟草花叶病毒tobaccomosaic virus(tmv)对烟草的侵染，提高拟南芥对丁香假单胞菌pseudomonas syringaepv.tomato dc3000(pst dc3000)的抗性等。

24、在更具体的实施方案中，诱导植物抗病性主要是诱导烟草叶片内ros的积累。

25、具体的，用2mg/ml的blh1纯蛋白对烟草叶片进行全叶片注射，可以诱导烟草叶片产生对tmv-gfp的抗性，减缓tmv-gfp在烟草叶片的复制。用2mg/ml的lblh1纯蛋白对拟南芥进行全叶片注射，可以诱导拟南芥对pst dc3000产生抗病性。用2mg/ml的blh1纯蛋白对烟草叶片进行全叶片注射，使用过氧化强特异性探针h2dcf-da对植物细胞内ros的积累进行检测，可以发现，blh1蛋白处理过的烟草叶片，其细胞内的荧光强度显著高于清水处理。

26、第六方面，本发明保护一种提高植物抗病能力的方法，所述方法包括提高植物中前文所述的蛋白激发子blh1的含量和/或活性。

27、在具体的实施方案中，所述提高植物中前文所述的蛋白激发子blh1的含量和/或活性通过对植物叶片进行全叶片注射来实现。

28、具体的，所述植物为烟草或拟南芥。

29、同现有技术相比，本发明的优点在于：

30、(1)本发明所述蛋白激发子blh1来自地衣芽孢杆菌b.licheniformis，不同于已报道的激发子，是一种新型分泌蛋白激发子，丰富了芽孢杆菌蛋白质激发子领域。

31、(2)本发明所述蛋白激发子blh1在2mg/ml时，可提高烟草对tmv-gfp的抗性以及拟南芥对pst dc3000的抗性。

32、(3)本发明所述蛋白激发子blh1在2mg/ml时，促进烟草叶片细胞内ros的积累。该发明为日后开发应用新的蛋白激发子及抗菌剂提供了理论支撑。

33、(4)由蛋白激发子开发的生防菌剂作用高效、安全无毒、易分解、无残留，具有广阔的应用前景

技术特征：

1.蛋白激发子blh1，其特征在于，是如下1)或2)的蛋白质：

2.编码权利要求1所述的蛋白激发子blh1的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，是如下1)或2)或3)的dna分子：

4. 扩增权利要求2或3所述基因的全长或任一片段的引物对；优选的，所述的引物对如seq id no:3-4所示。

5.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

6.权利要求1所述的蛋白激发子blh1和/或权利要求2或3所述的基因和/或权利要求5所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种，在如下（a1）-（a4）中的任一种应用：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草或拟南芥。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，病原菌为烟草花叶病毒或丁香假单胞菌。

9.一种提高植物抗病能力的方法，其特征在于，所述方法包括提高植物中权利要求1所述的蛋白激发子blh1的含量和/或活性。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述提高植物中权利要求1所述的蛋白激发子blh1的含量和/或活性通过对植物叶片进行全叶片注射来实现；

技术总结
本发明公开了蛋白激发子BLH1及其在提高植物抗病能力中的应用，本发明的蛋白激发子BLH1，其编码DNA序列如SEQ ID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的蛋白激发子BLH1可以诱导植物产生广谱抗病性，提高植物对细菌性斑点病和烟草花叶病毒的抗性，同时能够诱导烟草细胞内ROS的合成。该蛋白可以运用在提高植物抗病性方面。

技术研发人员：刘红霞,赵迎,袁志香
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14