一种南极硅藻类菌胞素氨基酸及其诱导表达、提取方法和应用与流程

本发明属于食品保健领域，特别涉及一种南极硅藻类菌胞素氨基酸及其诱导表达、提取方法和应用。

背景技术：

1、类菌胞素氨基酸(maas)在自然界中广泛分布，最早在真菌中发现，后来发现这种紫外吸收物质广泛分布于海洋生物。至今已发现的maas超过40多种，其分子量一般小于400da，具有光稳定性，极易溶于水，熔点高，热稳定性强，酸碱稳定性好，常分布在细胞质中，具有强大的紫外光保护作用。maas已知是在渗透胁迫下合成的，通过吸收紫外线辐射并以热量的形式耗散能量而不产生活性氧来保护细胞。maas不仅无毒、可生物降解，还具有高吸光度、抗氧化功能和光保护作用，使生物体能够抵御紫外线辐射，因而其可以作为防晒霜、细胞增殖激活剂、抗癌剂和抗光老化分子。过量的紫外辐射会导致白内障、免疫疾病和皮肤癌等疾病。因此，扩展提取maas的原料，探究maas的作用机制对防护紫外辐射具有重要意义。

2、藻类是产maas的主要群体，在自然界中藻类形成了一个多样化的群体，分布在各种各样的海洋生境中。南极硅藻ice-h，是自然资源部海洋第一海洋研究所生物活性物质重点实验室从2001-2002年第18次南极科学考察采集的南极海冰水样中分离。南极生存条件苛刻且南极的臭氧层空洞产生的较强紫外辐射对冰藻的生存也构成一定威胁。然而，关于从南极冰藻中提取maas的报道还很少，并且对于maas缓解紫外辐射损伤机制也不明确。因此，从南极硅藻ice-h中提取的maas对改善紫外氧化损伤的作用效果进行探究，可以为maas作为特殊功能活性物质辅助治疗紫外损伤提供理论支持，为maas的开发提供新的思路。

技术实现思路

1、本发明提供了一种南极硅藻类菌胞素氨基酸及其诱导表达、提取方法和应用。所述maas原料丰富且容易获得，安全性好，具有较强的体外抗氧化能力，为maas作为特殊功能活性物质辅助治疗紫外损伤提供理论支持。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、本发明提供了一种南极硅藻类菌胞素氨基酸的诱导表达、提取方法，其包括如下步骤：

4、(1)在南极硅藻培养基中加入含nh4+溶液后，再加入nacl并调节培养基的盐度，得到高盐培养基；

5、(2)将南极硅藻接种于所述步骤(1)的高盐培养基中培养，期间接受紫外辐射；

6、(3)将步骤(2)培养好的南极硅藻冷冻干燥后，将干燥粉使用甲醇水溶液浸提，得到的浸提液高速离心，上清液中即含有类菌胞素氨基酸。

7、进一步的，所述步骤(1)中含nh4+溶液选自nh4cl溶液，其浓度为60mol/l。

8、进一步的，所述步骤(1)中调节培养基的盐度至37‰。

9、进一步的，所述步骤(2)中紫外辐射具体步骤为：将南极硅藻放在60μw·cm-2的uvb紫外辐射下每天上下午各照射15min，累计照射4天。

10、进一步的，所述步骤(2)中南极硅藻接种于高盐培养基中，放置在5℃的恒温光照培养箱中培养7天。

11、进一步的，所述步骤(3)中甲醇水溶液选自25％甲醇水溶液，其与南极硅藻干燥粉的液固比为10:1。

12、进一步的，所述步骤(3)中浸提的温度为40℃，浸提时间为4h。

13、进一步的，所述南极硅藻选自南极硅藻phaeodactylum tricornutum ice-h。

14、本发明还提供了所述的诱导表达、提取方法制备得到的类菌胞素氨基酸，其包括占比不低于18％的shinorine和porphyra-334以及占比不低于35％的前体4-deoxygadusol。

15、本发明还提供了所述的类菌胞素氨基酸maas在抵抗紫外辐射损伤中的应用。

16、进一步的，所述maas能够增强对abts和dpph自由基的清除能力。

17、进一步的，所述maas能够降低由于uvb辐射导致的胶原纤维损伤、皮肤胶原纤维粘连、角质层变薄、表皮免受过度增生现象，改善小鼠氧化应激水平，降低ros、mda含量和提高hyp含量，抵抗uvb辐射对小鼠皮肤造成的光老化现象。

18、进一步的，所述maas能够抑制cox-2对紫外辐射的响应，下调il-1β和tnf-α的表达，介导nf-κb通路的激活。

19、进一步的，所述maas能够调节mapk蛋白家族(p38、jnk和erk蛋白激酶)，抑制mmps的表达，并减缓胶原蛋白的降解，保护小鼠背部皮肤免受uvb辐射损伤。

20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、1、本发明以南极硅藻phaeodactylum tricornutum ice-h为原料，用极性溶剂甲醇和氯仿对ice-h中的maas进行提取和初步纯化，并用gcb固相萃取柱对粗提液进行纯化；液质(lc-ms/ms)检测结果证实，南极硅藻ice-h中含有的maas为shinorine(m/z＝333，λmax＝332nm)、porphyra-334(m/z＝347，λmax＝334nm)以及前体4-dg(m/z＝189，λmax＝268nm)；其中20.83％为shinorine+porphyra-334，36.16％为4-dg。

22、2、本发明经过实验证实，在60μw·cm-2紫外辐射下总辐照2h、盐度为37‰、nh4cl浓度为60mmol/l诱导条件下，南极硅藻ice-h的maas产量最高；在提取溶剂甲醇为25％、固液比为1:10g/ml、提取温度为40℃时，南极硅藻ice-h的maas提取率最高。

23、3、本发明还通过比较maas体外抗氧化能力，小鼠背部皮肤急性紫外损伤情况、皮肤组织病理学分析、皮肤内ros含量以及氧化应激水平等指标，借助qrt-pcr和westernblot等手段，比较炎症因子、mapk、mmps表达量，验证得到maas对保护小鼠皮肤抵抗紫外辐射具有改善效果，为探究maas对uvb损伤小鼠背部皮肤的抗氧化机制打下了基础。

技术特征：

1.一种南极硅藻类菌胞素氨基酸的诱导表达、提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的诱导表达、提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中含nh4+溶液选自nh4cl溶液，其浓度为40～80mol/l。

3.根据权利要求1所述的诱导表达、提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中调节培养基的盐度至35～38‰。

4.根据权利要求1所述的诱导表达、提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中紫外辐射具体步骤为：将南极硅藻放在60μw·cm-2的uvb紫外辐射下每天上下午各照射15min，累计照射2～5天。

5.根据权利要求1所述的诱导表达、提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中南极硅藻接种于高盐培养基中，放置在5℃的恒温光照培养箱中培养7天。

6.根据权利要求1所述的诱导表达、提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中甲醇水溶液选自25％甲醇水溶液，其与南极硅藻干燥粉的液固比为5～15:1。

7.根据权利要求1所述的诱导表达、提取方法，其特征在于，所述步骤(3)中浸提的温度为35～45℃，浸提时间为4～6h。

8.根据权利要求1所述的诱导表达、提取方法，其特征在于，所述南极硅藻选自南极硅藻phaeodactylum tricornutum ice-h。

9.权利要求1-8任一项所述的诱导表达、提取方法制备得到的类菌胞素氨基酸，其特征在于，所述类菌胞素氨基酸包括占比不低于18％的shinorine和porphyra-334以及占比不低于35％的前体4-deoxygadusol。

10.权利要求9所述的类菌胞素氨基酸在抵抗紫外辐射损伤中的应用。

技术总结
本发明公开了一种南极硅藻类菌胞素氨基酸及其诱导表达、提取方法和应用。本发明以南极硅藻Phaeodactylum tricornutum ICE‑H为原料，经实验证实，在60μW·cm<supgt;‑2</supgt;紫外辐射下总辐照2h、盐度为37‰、NH<subgt;4</subgt;Cl浓度为60mmol/L诱导条件下，南极硅藻ICE‑H的MAAs产量最高；在提取溶剂甲醇为25％、固液比为1:10g/mL、提取温度为40℃时，南极硅藻ICE‑H的MAAs提取率最高。本发明还经实验证实MAAs对保护小鼠皮肤抵抗紫外辐射具有改善效果，为探究MAAs对UVB损伤小鼠背部皮肤的抗氧化机制打下了基础。

技术研发人员：何英英,缪锦来,曲长凤,邓雅珊,梁绍鑫
受保护的技术使用者：自然资源部第一海洋研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16