一种新型磷脂酶A2的基因、制备方法与应用

本发明属于生物，本发明涉及一种新型磷脂酶a2的基因、制备方法与应用。

背景技术：

1、磷脂酶a2(phospholipase a2，pla2)是一类水解酶超家族，能够催化甘油磷脂上二位酰基(sn-2)水解，释放溶血磷脂和游离脂肪酸。根据氨基酸序列、对ca2+的依赖性、存在部位和生理功能等差异，pla2被分为以下6个类型：分泌型pla2(spla2)、胞内型pla2(cpla2)、非ca2+依赖型pla2(ipla2)、血小板活化因子乙酰水解酶(paf-ah)、脂蛋白相关pla2(lpla2)、脂肪型pla2(adpla2)。

2、其中spla2广泛存在于各种生物体和组织中。spla2是各种有毒动物毒液的主要成分之一。参与毒蛇麻痹猎物、捕食、消化活动，还表现出多种毒理和药理活性，如溶血活性、抗凝活性、诱导或抑制血小板聚集、神经毒性、肌肉毒性等。spla2作为蜂毒的主要成分，可引起严重的过敏反应。除此之外，在多种昆虫体内还发现了非毒性的spla2，参与了昆虫的生长发育和免疫过程。spla2的另一大来源则是哺乳动物。研究人员最初从哺乳动物的胰腺中发现spla2，后续从人类关节炎滑液、血小板、精浆、巨噬细胞、上皮细胞、中性粒细胞、t细胞等多种组织或细胞中发现，这种酶在生物体内可以通过形成炎性因子参与多种炎症反应。

3、spla2具有很高的应用价值，在磷脂改性、油脂精练、饲料添加、科研与医疗等方面已有不少研究。并且，与其他类型的pla2相比，spla2的来源更为广泛，这意味着spla2具有广阔的应用前景。同时，spla2在生物体内还具有多种生理功能，如参与磷脂代谢、抗菌、抗病毒、炎症反应、细胞膜重建和细胞增殖等。目前，spla2大多来源于有毒生物和脊椎动物，因此开发新物种来源的spla2具有广阔的应用前景。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明提供一种新型磷脂酶a2的基因、制备方法与应用。本发明具体提供一种来源于海洋棘皮动物仿刺参种属的分泌型磷脂酶a2基因的编码序列及仿刺参磷脂酶a2的氨基酸序列。构建了表达仿刺参磷脂酶a2的基因工程菌株，并分离纯化获得了重组仿刺参磷脂酶a2蛋白。该蛋白不仅能够催化甘油磷脂的sn-2位酯键水解，生成脂肪酸和溶血磷脂，还能够抑制一些海洋细菌的生长。

2、本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

3、本发明通过trizol法提取仿刺参肠道组织总rna，反转录获得cdna第一链文库；根据磷脂酶a2基因的保守区域设计上下游引物p1(5’-gtagctcagtttggagacatgata-3’)和p2(5’-ggcgccctccatatcgcat ttaca-3’)，利用pcr技术获得了仿刺参磷脂酶a2编码基因的部分序列；进一步利用5’race和3’race技术克隆出仿刺参磷脂酶a2基因的全长cdna序列；利用生物信息学方法分析确定了仿刺参磷脂酶a2基因的编码序列和仿刺参磷脂酶a2蛋白的氨基酸序列。

4、本发明第一个目的是请求保护一种仿刺参磷脂酶a2基因，其具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。完整的核苷酸序列长度931bp，包含99bp的5’端非编码区和352bp的3’端非编码区，3’端utr含有一个多聚腺苷酸加尾信号(aataaa)和真核生物mrna特有的poly(a)。

5、本发明第二个目的是请求保护一种仿刺参磷脂酶a2基因编码蛋白的密码子，其具有如seq id no.2所示的核苷酸序列。

6、本发明第三个目的是请求保护一种仿刺参磷脂酶a2基因编码的蛋白，其具有如seq id no.3氨基酸序列。

7、仿刺参磷脂酶a2蛋白共含有159个氨基酸，其中包含编码16个氨基酸的信号肽序列(mkflvliilvitdvaa)和编码5个氨基酸的前导肽序列(yrgrr)，其余为编码138个氨基酸的成熟肽序列。

8、本发明第四个目的是请求保护一种构建表达仿刺参磷脂酶a2的基因工程菌株，并分离纯化获得了重组仿刺参磷脂酶a2蛋白的制备方法；具体步骤如下所示：

9、(1).以pet32a为表达载体，bamh i为限制性酶切位点，设计含有同源臂的上游引物pet 32a-f：5’-acggagctcgaattcggatcc tcaacacctgtctctaggata acttttg-3’和下游引物pet 32a-r：5’-gccatggctgata tcggatccggtgtaactcagt ttggagaaatgata-3’(小写字母为同源臂序列)，以仿刺参spla2成熟肽序列为模板，pcr扩增带有同源臂的仿刺参磷脂酶a2的编码序列片段,其核苷酸序列如seq id no.2所示。

10、(2).将步骤(1)的pcr扩增带有同源臂的仿刺参磷脂酶a2的编码序列片段和线性化载体pet32a通过无缝克隆技术连接，构建重组质粒pet 32a-ajspla2。

11、(3).将重组质粒pet 32a-ajspla2转入表达宿主大肠杆菌rosetta gami(de3)中，获得重组菌rosetta(de3)/pet 32a-ajspla2，利用iptg对重组仿刺参spla2蛋白进行诱导，获得可溶性重组仿刺参磷脂酶a2蛋白。

12、(4).对重组菌rosetta(de3)/pet 32a-ajspla2的诱导表达条件进行优化，确定最佳表达条件为，活化的重组菌转接后以37℃培养2.5小时，加入终浓度为0.1mmol/l的iptg，以25℃诱导培养16小时。

13、(5).利用ni2+亲和柱，分离纯化出高纯度的重组蛋白rajspla2。

14、本发明第五个目的是请求保护重组仿刺参磷脂酶a2蛋白在催化水解甘油磷脂的应用。

15、本发明第五个目的是请求保护重组仿刺参磷脂酶a2蛋白在对海洋致病菌的抑制方面的应用。

16、本发明与现有技术相比的有益效果是：

17、本发明以仿刺参为研究对象，在仿刺参基因组中鉴定出仿刺参磷脂酶a2基因的序列，并对其进行克隆，利用大肠杆菌表达系统表达、获得具有生物活性的重组仿刺参磷脂酶a2蛋白。重组仿刺参磷脂酶a2蛋白不仅能够催化甘油磷脂的sn-2位酯键水解，生成脂肪酸和溶血磷脂，还对一些海洋致病菌具有抑制作用。

技术特征：

1.一种仿刺参磷脂酶a2基因，其特征是，其具有如seq id no.1所示的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的一种仿刺参磷脂酶a2基因编码蛋白的密码子，其特征是，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.如权利要求1所述的一种仿刺参磷脂酶a2基因编码的蛋白，其特征是，其氨基酸序列如seq id no.3所示。

4.如权利要求1所述的仿刺参磷脂酶a2基因其重组仿刺参磷脂酶a2蛋白的制备方法，其特征是，具体步骤如下所示：

5.如权利要求4制备方法制备的重组仿刺参磷脂酶a2蛋白在催化水解甘油磷脂的应用。

6.如权利要求4制备方法制备的重组仿刺参磷脂酶a2蛋白在对海洋致病菌的抑制方面的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，公开了一种新型磷脂酶A2的基因、制备方法与应用。本发明具体提供一种来源于海洋棘皮动物仿刺参种属的分泌型磷脂酶A2基因的编码序列及仿刺参磷脂酶A2的氨基酸序列。构建了表达仿刺参磷脂酶A2的基因工程菌株，并分离纯化获得了重组仿刺参磷脂酶A2蛋白。该蛋白不仅能够催化甘油磷脂的sn‑2位酯键水解，生成脂肪酸和溶血磷脂，还能够抑制一些海洋细菌的生长。

技术研发人员：李成,刘影,徐子一,王亮
受保护的技术使用者：大连工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15