一种制备亮斑扁角水虻增重品系的方法及其核酸构建物与流程

本发明属于生物，具体涉及一种制备亮斑扁角水虻增重品系的方法及其核酸构建物

背景技术：

1、亮斑扁角水虻(hermetia illucens)，俗名黑水虻，隶属双翅目，水虻科，是一种重要的资源昆虫。幼虫以自然界腐烂的有机物和动物粪便为食。这种食性在人工环境的治理方面存在巨大应用价值。黑水虻的生长发育周期为40-45天，繁殖能力与适应能力均很强，便于大规模人工饲养，用于高效处理餐厨垃圾及畜禽粪便等有机废弃物。此外，黑水虻幼虫在取食有机废弃物的过程中，可以显著减少其中的病原菌，同时有效抑制家蝇的繁殖。

2、黑水虻幼虫在转化有机废弃物过程中能够同化富集有机废弃物中的蛋白质和油脂，具有很高的营养价值。取食餐厨垃圾的黑水虻5龄幼虫中，蛋白质干重含量达37％-44％，油脂干重含量达30％-37％，同时废弃物中的残留农药、抗生素等不易在幼虫体内富集。这些特性使得黑水虻可作为家畜及水产养殖饲料的备选来源，可部分取代鱼粉、豆粕等传统动植物蛋白。同时黑水虻处理有机废弃物过程中，产生的虫粪富含氮素，作为土壤改良剂具有很高利用价值。

3、基于在处理有机垃圾、实现废弃物经济循环方面广阔的应用前景，黑水虻进入越来越多研究者的视野，并在诸多方面取得显著进展，但是在种质开发上，仍进展缓慢。如何加快幼虫发育速度，如何增加幼虫个体质量，如何提高虫体粗蛋白/油脂含量，是亟待解决的种质开发问题。基于crispr的基因编辑技术是对物种进行定向性状改良的强大工具，而靶标基因的选择是继编辑技术成熟后的核心难点。目前鲜见基于基因编辑技术，开发经济性状更为优良品系的成功实施案例。因此，针对黑水虻经济性状改良的合适靶标基因，是市场急需的。

技术实现思路

1、本发明人经过广泛调研和筛选发现，脂滴存储相关蛋白编辑基因是针对黑水虻经济性状改良的有效靶标。突变性状相对稳定，发育周期变化较小、繁殖能力影响较小的靶标基因是作为候选的第一条件，在此基础上，有效提高虫体体重、粗蛋白/油脂含量是作为候选的第二条件。脂滴存储相关蛋白参与脂滴融合，在黑水虻中，其突变体影响脂滴利用，可促进生长发育。因此本发明提供了一个脂滴存储相关蛋白编辑基因(lsd1)作为靶标用于黑水虻增重品系的开发从而完成了本发明。

2、因此，为了实现黑水虻基因靶向编辑的增重品系开发，本发明的目的是提供了一个脂滴存储相关蛋白编辑基因(lsd1)作为靶标及所用的核酸构建物，该品系表型为幼虫个体增重。

3、本发明的技术方案如下：一种制备亮斑扁角水虻增重品系的方法及其核酸构建物，包括以下步骤：

4、(1)构建lsd1基因敲除核酸构建物，将模板引物sgrna-f与通用反向引物进行pcr，将pcr产物回收纯化，即得模板sgrna，其中，模板引物sgrna1-f的序列如序列表中seq no.2所示，sgrna2-f的序列如序列表中seq no.3所示，sgrna3-f的序列如序列表中seq no.4所示，sgrna4-f的序列如序列表中seq no.5所示，通用反向引物的序列如序列表中seq no.6所示；

5、(2)将步骤(1)所述的sgrna模板进行体外大量扩增，获得单链状态sgrna，即得敲除核酸构建物；

6、(3)将步骤(2)所述敲除核酸构建物和cas9蛋白共转亮斑扁角水虻新鲜昆虫卵，孵化获得g0代，检测存在突变，自交得g1代；

7、(4)将所述g1代突变杂合体进行2-3代自交，检测获得纯合体，即得，进行传代饲养即可。

8、步骤(1)中，所述的pcr是常规的，较佳的，所述的pcr的反应体系如下：10x kodplus缓冲液5μl；2mm dntp混合液5μl；25nm mgso4 3μl；模板引物2μl；通用反向引物2μl，kod plus酶0.5μl；无菌双蒸水32.5μl。较佳的，步骤(1)中所述的pcr的反应条件如下：94℃2min；94℃15s，55℃30s，68℃10s，20个循环；68℃5min。

9、步骤(2)中，所述的体外大量扩增是常规的，较佳的使用试剂盒进行。较佳的，所述的单链状态sgrna的序列如序列表中seq no.7所示或seq no.8所示或seq no.9所示或seqno.10所示。

10、步骤(3)所述的cas9蛋白是常规的，较佳的购自thermo fisher公司。较佳的，所述的sgrna和cas9蛋白的终浓度各自为100-200ng/μl。较佳的，步骤(3)中所述的共转在显微注射仪中进行。较佳的，步骤(3)中所述的孵化的温度为25-28℃

11、步骤(4)中所述杂合突变体，较佳的为导致提前终止表达的基因型。

12、本发明还提供了一种黑水虻的lsd1基因敲除的模板引物，其序列如序列表中seqno.2所示或seq no.3所示或seq no.4所示或seq no.5所示。

13、本发明还提供了一种黑水虻的lsd1基因敲除的sgrna，其序列如序列表中seqno.7所示或seq no.8所示或seq no.9所示或seq no.10所示。

14、本发明利用基因编辑技术实现了lsd1基因的成功敲除，检测到了基因组层面上两个相应靶点的突变。突变体基因型的正确性可通过pcr扩增及测序进行判定；突变体的表型可通过5龄幼虫个体称重及脂滴染色进行判断。本发明提供的靶lsd1基因对黑水虻幼虫体重具有明显影响，可以作为增重品系开发的靶标基因。

技术特征：

1.一种制备亮斑扁角水虻增重品系的方法，其特征在于，依次包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的pcr反应条件如下：94℃2min；94℃15s，55℃30s，68℃10s，20个循环；68℃5min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的敲除核酸构建物和cas9蛋白的终浓度各自为100-200ng/μl。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的共转在显微注射仪中进行。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的孵化的温度为25-28℃。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述检测存在突变为使用检测引物进行pcr检测。

7.一种黑水虻的lsd1基因敲除的模板引物，其特征在于，其序列如序列表中seq no.2所示或seq no.3所示或seq no.4所示或seq no.5所示。

8.一种黑水虻的lsd1基因敲除的sgrna，其特征在于，其序列如序列表中seq no.7所示或seq no.8所示或seq no.9所示或seq no.10所示。

技术总结
本发明公开了一种制备亮斑扁角水虻增重品系的方法及其核酸构建物。其方法包括：1)构建Lsd1基因敲除核酸构建物，将模板引物sgRNA‑F与通用反向引物进行PCR，将PCR产物回收纯化，即得模板sgRNA；2)将所述的sgRNA模板进行体外大量扩增，获得单链状态sgRNA，即得敲除核酸构建物；3)将所述构建物和Cas9蛋白共转亮斑扁角水虻新鲜昆虫卵，孵化获得G0代，检测存在突变，自交得G1代；和，4)将所述G1代突变杂合体进行2‑3代自交，检测获得纯合体，即得。本发明利用CRISPR/Cas9技术成功构建了体重增大的亮斑扁角水虻品系，在亮斑扁角水虻的资源化利用方面具有重要价值。

技术研发人员：孔德靖,孙开济,李培丽,王卫卫
受保护的技术使用者：上海慧福德生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/5/8