一种无细胞体系全酶法微环DNA的制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种无细胞体系全酶法微环dna的制备方法及其应用。

背景技术：

1、基因治疗是将有治疗作用或正常基因的dna序列导入靶细胞，通过纠正基因缺陷或发挥治疗作用而达到治疗疾病的目的。基因治疗的关键技术之一是研发用于真核细胞转移基因的安全有效的载体系统，目前用于基因治疗的载体大致可分为两类，病毒载体和非病毒载体。病毒载体存在整合到宿主基因组、免疫原性等潜在风险，传统的质粒载体相对于病毒载体转染率低，但相对安全。传统质粒载体中含有细菌复制序列、抗性基因、未甲基化的cpg基序和一些可能隐藏的表达信号，这些序列在质粒复制时是必需的，但在基因治疗中可能引起严重的临床安全性问题，此外，抗性基因会通过水平基因转移的方式在宿主体内传播。

2、微环dna是传统质粒在大肠杆菌中通过位点特异性重组得到的一种新颖的小环超螺旋表达框，其不含有抗性标记基因、复制原点等细菌序列，增强了在临床应用上的安全性。与病毒载体、质粒载体相比，无论是在体内还是体外进行基因表达，微环dna减少了发生炎症和基因沉默的可能，表达周期更久。

3、kay ma,he cy,chen zy.a robust system for production of minicircle dnavectors[j].nat biotechnol,2010,28(12):1287-1289.doi:10.1038/nbt.1708.公开了一种在大肠杆菌细胞内通过bp重组系统制备微环dna的方法，具体步骤包括：将含有亲本质粒的大肠杆菌zycy10p3s2t培养12-16h，在阿拉伯糖的诱导作用下，大肠杆菌zycy10p3s2t表达重组酶phic31和识别i-sce位点的核酸内切酶。phic31介导亲本质粒attb和attp重组，亲本质粒产生微环dna和骨架dna。核酸内切酶特异性识别骨架dna的i-sce位点，骨架dna被剪切成线性dna而被dna酶消化。微环dna经亲和柱吸附提取后即获得微环dna。但微环dna在体内重组的产物，由于位点特异性重组酶和内切酶的表达强度不够，位点特异性重组的效率比较低，导致了骨架载体和/或亲本质粒的残留，给微环dna的临床应用带来了隐患。

4、因此，有必要提供一种微环dna的制备方法及其应用，彻底去除微环dna中存在的骨架载体和/或亲本质粒，扩大微环dna基因治疗的范围，满足临床质粒产品和药用的要求。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种无细胞体系全酶法微环dna的制备方法及其应用，具有高效快速的特点，较细胞内制备方法具有重复性好、纯度高、成本低的优势。

2、基因治疗表达框架指含启动子、增强子、编码蛋白的基因与转录终止信号元件的dna构建。

3、无细胞聚合酶法dna复制体系指在体外通过dna聚合酶的聚合作用利用dntp和模板为原料进行dna复制与扩增的体系。

4、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

5、第一方面，本发明提供一种无细胞体系全酶法微环dna的制备方法，具体包括如下步骤：

6、步骤1：在基因治疗表达框架的两侧分别加上attb与attp位点，基因合成后克隆入骨架载体，获得重组质粒；

7、步骤2：采用无细胞酶法dna复制体系扩增步骤1获得的重组质粒，并针对扩增后的重组质粒进行第一次纯化处理，获得大量聚合酶复制产物，溶解在灭菌双蒸水或稀tris-hcl缓冲液中，用于后续微环dna的制备；

8、步骤3：步骤2获得的聚合酶复制产物在整合酶的作用下，分离成微环dna和副产物骨架载体，并进行第二次纯化处理；

9、步骤4：在步骤3纯化后的微环dna与骨架载体的混合液中，加入1/10体积的10×cutsmart反应buffer与限制性内切酶和核酸外切酶。利用限制性内切酶将骨架载体切除线性dna，然后利用核酸外切酶进一步降解掉线性dna，并进行第三次纯化处理，得到高纯度微环dna。

10、优选地，所述基因治疗表达框架通过密码子优化与序列优化，保证基因治疗表达框架序列不含有apali酶切位点。

11、优选地，所述attb的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述attp的核苷酸序列如seq id no:2所示。

12、attb序列(seq id no:1)：

13、cggtgcgggtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgcgtactccac

14、attp序列(seq id no:2)：

15、gtagtgccccaactggggtaacctttgagttctctcagttgggggcgtag

16、优选地，所述无细胞聚合酶法dna复制体系包括pcr复制体系，phi29滚环复制体系，等温扩增体系；更优选为phi29 dna聚合酶。

17、优选地，所述整合酶为整合酶phic31，所述限制性内切酶为限制性内切酶apali，所述核酸外切酶为外切酶iii。

18、优选地，所述骨架载体包括puc57，pbr322，pbluescript，pcdna；更优选为大肠杆菌puc57载体。

19、优选地，所述纯化方法包括但不限于磁珠纯化、硅胶吸附膜纯化、色谱层析纯化。

20、第二方面，本发明提供一种高纯度微环dna，所述高纯度微环dna通过使用第一方面所述的无细胞体系全酶法微环dna的制备方法获得。

21、第三方面，本发明提供第一方面所述的无细胞体系全酶法微环dna的制备方法在基因治疗中的应用。

22、优选地，所述应用包括dna疫苗、遗传代谢缺陷病、镰刀型贫血、地中海贫血、抗肿瘤研究或干细胞研究。

23、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

24、本发明通过构建含有基因治疗表达框架的重组质粒，经过聚合酶体外扩增，在整合酶的作用下分离成微环dna和骨架载体，然后利用限制性内切酶将骨架载体切除线性dna，再用核酸外切酶进一步降解掉线性dna，达到彻底去除骨架载体的目的，从而获得高纯度的微环dna。本发明采用无细胞体系的全酶法dna复制体系制备高纯度微环dna，较细胞内制备方法具有重复性好、纯度高、成本低的优势，同时能够扩大微环dna基因治疗的范围，满足临床质粒产品和药用的要求，具有极大的市场前景。

技术特征：

1.一种无细胞体系全酶法微环dna的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基因治疗表达框架通过密码子优化，去除apali酶切位点。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述attb的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述attp的核苷酸序列如seq id no:2所示。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述无细胞聚合酶法dna复制体系包括pcr复制体系，phi29滚环复制体系，等温扩增体系；

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述整合酶为整合酶phic31，所述限制性内切酶为限制性内切酶apali，所述核酸外切酶为外切酶iii。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述骨架载体包括puc57，pbr322，pbluescript，pcdna；

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化包括磁珠纯化、硅胶吸附膜纯化、色谱层析纯化。

8.一种高纯度微环dna，其特征在于，所述高纯度微环dna使用权利要求1～7任一项所述方法制备。

9.权利要求1-7任一项所述的制备方法在基因治疗中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括dna疫苗、遗传代谢缺陷病、镰刀型贫血、地中海贫血、抗肿瘤研究或干细胞研究。

技术总结
本发明提供了一种无细胞体系全酶法微环DNA的制备方法及其应用，通过构建含有基因治疗表达框架的重组质粒，经过聚合酶体外扩增，在整合酶的作用下分离成微环DNA和骨架载体，然后利用限制性内切酶将骨架载体切除线性DNA，再用核酸外切酶进一步降解掉线性DNA，达到彻底去除骨架载体的目的，从而获得高纯度的微环DNA。本发明采用无细胞体系的全酶法DNA复制体系制备高纯度微环DNA，较细胞内制备方法具有重复性好、纯度高、成本低的优势。

技术研发人员：柳伟强,付煜烨,许映冲,黄国帅,徐杰,齐金才,何腾飞,申姝茵,杨平
受保护的技术使用者：苏州泓迅生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15