一种PolyA检测方法与流程

本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种polya检测方法。

背景技术：

1、细胞信使rna（mrna）在真核生物细胞中广泛存在，负责传递遗传信息，指导蛋白质合成。mrna是一种近来备受关注的基因治疗手段，在肿瘤学、传染病学、蛋白疗法等领域有广泛前景。mrna的polya尾是体外合成mrna（ivt mrna）的重要结构元件，通常由两种途径加入：一种由模板编码polyt转录形成；另一种由多聚腺苷酸聚合酶在转录mrna 3端将腺苷酸催化聚合形成。由于mrna polya尾对ivt mrna的翻译效率及胞内稳定性起着至关重要的作用，因此polya尾长及占比是ivt mrna的关键工艺质量参数，对mrna polya尾长及占比的有效及准确的表征是非常必要且重要的。

2、当前polya尾长的检测方法主要为：1）酶切法将polya尾通过一定酶切前处理从mrna中切除并分离后进行液相色谱－质谱联用分析，该方法一方面对polya的结构及内部序列有一定限制，例如利用rnase t1酶对mrna进行酶切处理，特异性切割相邻核苷酸的3'－鸟苷残基和 5'-oh 残基之间的磷酸二酯键，限制了polya序列含鸟苷残基的ivt mrna的检测，另一方面液质联用仪器成本较高。2）多聚腺苷酸聚合酶加尾过程中利用atp的消耗量与mrna加尾长度的关系监测mrna polya尾长度，该法仅适用转录后加尾的工艺过程，对模板编码polyt转录polya尾不适用。3）基于epat法或lm-pat法对polya进行检测时，可获得较为准确的polya长度，但其对不同polya长度及占比的分析相关性较差，不能有效定义ivtmrna的理论polya长度的占比。

3、由此可见，提供一种能够准确检测不同mrna polya尾长及占比的方法，且具有成本低、方便操作、结果安全可靠的优点，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、本申请实施例通过提供一种polya检测方法，解决了现有技术中操作过程繁复、准确性不高等缺陷，提供了准确检测不同mrna polya尾长及占比的方法，能够适用模板编码polyt转录polya尾长检测，有效定义ivt mrna的理论polya长度的占比。

2、本申请实施例提供了一种polya检测方法，包括以下步骤：

3、步骤1：在polya聚合酶反应体系中对待测靶mrna进行加尾反应；

4、步骤2：将加尾后的mrna加入反转录反应体系，以特异性反转引物进行反转录形成cdna；

5、步骤3：于待测polya上游位置设计的特异性正向引物与反向引物，对反转录形成的cdna进行聚合酶链式反应得到聚合酶链式反应产物；

6、步骤4：对所述聚合酶链式反应产物进行分离及大小分析，得到polya尾长。

7、优选地，所述步骤1中，以gtp及itp的混合溶液作为底物对待测靶mrna进行加尾反应，使待测靶mrna在3端加入g/i尾。

8、本发明通过以gtp及itp的混合溶液替代atp作为底物进行加尾反应，可在polya尾后加入一定长度的g/i尾，有效稳定polya尾。解决了现有技术中对各长度polya不能等量检出的问题，实现目的polya长度占比的精确检测。

9、进一步优选地，所述步骤1中，取1μg mrna加入所述polya聚合酶反应体系，所述polya聚合酶反应体系包括，在1×缓冲液下，使用5u polya聚合酶，gtp溶液与itp溶液各为10pmol，于37℃反应60min，得到加尾后mrna。

10、优选地，所述特异性反转引物序列如seq id no .1所示。

11、进一步优选地，取5μl加尾后mrna加入反转录反应体系，所述反转录反应体系包括，在1×缓冲液下，取1μl反转录酶、50pmol特异性反转引物于42℃反应60min后于90℃酶失活反应10min，得到反转录产物cdna。

12、优选地，所述步骤3中，所述正向引物序列如seq id no .2所示，所述反向引物序列如seq id no .3所示。

13、本发明所确定的特异性反转引物序列设计为特异性引物序列且含有可与g/i尾配对进行反转录的polyc及可与polya尾配对的polyt，可实现polya长度的精确定量。正向引物序列为靶mrna特异性序列，反向引物序列以特异性反转引物序列得出，可从理论上判定聚合酶链式反应产物大小，从而精确判断mrna polya尾长。

14、进一步优选地，所述步骤3中，取5μl反转录产物cdna加入聚合酶链式反应体系中，所述聚合酶链式反应体系包括，在1×缓冲液下，加入3.75u聚合酶，取10pmol正向引物和10pmol反向引物，扩增条件为94℃初始变性2分钟，94℃持续10s，65℃持续10s，72℃持续10s，共做30次循环，最后保持在12℃。

15、优选地，所述步骤4中，利用琼脂糖凝胶电泳及dna分子标准量对所述聚合酶链式反应产物进行分离及大小分析，得到所述polya尾长。

16、优选地，所述待测靶mrna为包含不同模板编码polya长度的mrna。本发明的方法能够实现不同模板编码polya长度的检测。

17、优选地，还包括步骤5：对凝胶成像分析时，利用灰度值分析方法分析所述凝胶成像电泳图条带，得到各polya长度占比。

18、通过选择利用琼脂糖凝胶电泳方法和灰度值分析方法来检测不同polya尾长和各polya的占比，检测的数值结果准确易得，便于操作且成本低。

19、本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

20、本申请提供的检测方法，可针对不同mrna序列进行上游引物序列设计并检测分析，可检测多种poly长度及占比值，成本低，易操作，可如实反映ivt mrna的目的polya长度占比。

技术特征：

1.一种polya检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的polya检测方法，其特征在于：所述步骤1中，以gtp及itp的混合溶液作为底物对待测靶mrna进行加尾反应，使待测靶mrna在3端加入g/i尾。

3.根据权利要求2所述的polya检测方法，其特征在于：所述步骤1中，取1μg mrna加入所述polya聚合酶反应体系，所述polya聚合酶反应体系包括，在1×缓冲液下，使用5upolya聚合酶，gtp溶液与itp溶液各为10pmol，于37℃反应60min，得到加尾后mrna。

4.根据权利要求1所述的polya检测方法，其特征在于：所述步骤2中，所述特异性反转引物序列如seq id no .1所示。

5.根据权利要求4所述的polya检测方法，其特征在于：取5μl加尾后mrna加入反转录反应体系，所述反转录反应体系包括，在1×缓冲液下，取1μl反转录酶、50pmol特异性反转引物于42℃反应60min后于90℃下酶失活反应 10min，得到反转录产物cdna。

6.根据权利要求1所述的polya检测方法，其特征在于：所述步骤3中，所述正向引物序列如seq id no .2所示，所述反向引物序列如seq id no .3所示。

7.根据权利要求6所述的polya检测方法，其特征在于：所述步骤3中，取5μl反转录产物cdna加入聚合酶链式反应体系中，所述聚合酶链式反应体系包括，在1×缓冲液下，加入3.75u聚合酶，取10pmol正向引物和10pmol反向引物，扩增条件为94℃初始变性2分钟，94℃持续10s，65℃持续10s，72℃持续10s，共做30次循环，最后保持在12℃。

8.根据权利要求1所述的polya检测方法，其特征在于：所述步骤4中，利用琼脂糖凝胶电泳及dna分子标准量对所述聚合酶链式反应产物进行分离及大小分析，得到所述polya尾长。

9.根据权利要求1所述的polya检测方法，其特征在于：所述待测靶mrna为包含不同模板编码polya长度的mrna。

10.根据权利要求9所述的polya检测方法，其特征在于：还包括步骤5：对凝胶成像分析时，利用灰度值分析方法分析所述凝胶成像电泳图条带，得到各polya长度占比。

技术总结
本发明公开了一种PolyA检测方法，包括以下步骤：在PolyA聚合酶反应体系中对待测靶mRNA进行加尾反应；将加尾后的mRNA加入反转录反应体系，以特异性反转引物进行反转录形成cDNA；于待测PolyA上游位置设计的特异性正向引物和反向引物对反转录形成的cDNA进行聚合酶链式反应得到聚合酶链式反应产物；对所述聚合酶链式反应产物进行分离及大小分析，得到PolyA尾长。本发明解决了现有技术中PolyA检测操作过程繁复、准确性不高等缺陷，提供了准确检测不同mRNA PolyA尾长及占比的方法，能够适用模板编码polyT转录PolyA尾长检测，有效定义IVT mRNA的理论PolyA长度的占比。

技术研发人员：贾明明,陈立,朱伟萍
受保护的技术使用者：北京立康生命科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14