连续催化产生柠檬烯及香芹醇的LaTPS7和LaCYP71D582及应用

本发明涉及芳香植物分子生物学和基因工程，更具体地说是涉及柠檬烯单萜合酶latps7及其氢化酶细胞色素p450lacyp71d582、编码基因及应用。确立了其产物柠檬烯和香芹醇在蚜虫和瓢虫的气味选择行为的影响。

背景技术：

1、狭叶薰衣草(lavandula angustifolia)是唇形科薰衣草属的灌木。其精油含有多种单萜和倍半萜类化合物，常被添加于日用品和芳香疗法中，具有助眠，减压，驱虫的功效。现代研究表明，薰衣草精油在治疗焦虑症、抑郁症和某些癌症中均发挥着积极的作用。

2、单萜化合物是组成薰衣草精油的主要化合物，其中香芹醇被认为是由柠檬烯羟基化而产生。柠檬烯具有防腐、消炎、抗菌、抗氧化等生物活性功能。而香芹醇是用于食品添加剂、香料、抗氧剂、驱虫剂、卫生杀菌剂、防腐剂、脱味剂、医药中间体等领域的重要产品。化学合成柠檬烯和香芹醇面临着步骤繁琐、环境污染等问题，因此利用生物工程技术，建立微生物工厂合成天然物质，同时研究并开发薰衣草精油的新功能和新应用同样具有极大的应用前景。

3、之前的研究报道，在薰衣草中已克隆获得柠檬烯合酶(lalims)，同时在薄荷中已发现柠檬烯-6-脱氢酶。然后以上研究仅进行了体外酶活验证，并无进行体内活性验证。同时薰衣草中的柠檬烯-6-脱氢酶以及相关产物在昆虫行为中的影响也并未报道。薰衣草精油具有复杂多用的萜类物质，对萜类生物催化相关基因进行克隆并细致研究有助于为芳香植物调控产生芳香性物质的机理提供理论基础，也为薰衣草基因精准育种，基因工程技术生产柠檬烯和香芹醇提供应用空间。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种催化合成柠檬烯和香芹醇的蛋白酶和编码基因，以及柠檬烯和香芹醇在蚜虫防治中的应用。

2、本发明首先提供了薰衣草latps7蛋白，其为：

3、1)seq id no.2所示的氨基酸序列；

4、2)与seq id no.2所示的序列具有相同功能，且通过取代缺失或增加一个或多个氨基酸而衍生的蛋白；

5、3)与seq id no.2所示的蛋白具有相同功能，且n端或c端连接标签得到的融合蛋白质。

6、上述蛋白质，蛋白标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。

7、还提供了一种编码所述latps7蛋白的基因，其中，所述基因为如下中至少一种：

8、1)核苷酸序列如seq id no.1所示；

9、2)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的dna分子；

10、3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有90％以上的同一性且编码所述蛋白质的核苷酸序列；

11、4)由seq id no.1所示的序列通过取代、缺失或增加核苷酸而获得的序列；

12、5)由seq id no.1所示的核苷酸序列产生不同的转录本或者同源基因序列。

13、本发明还提供薰衣草lacyp71d582蛋白，其为：

14、1)seq id no.4所示的氨基酸序列；

15、2)与seq id no.4所示的序列具有相同功能，且通过取代缺失或增加一个或多个氨基酸而衍生的蛋白；

16、3)与seq id no.4所示的蛋白具有相同功能，且n端或c端连接标签得到的融合蛋白质。

17、还提供了编所述lacyp71d582蛋白的基因。

18、其中，所述基因为如下中至少一种：

19、1)核苷酸序列如seq id no.3所示；

20、2)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的dna分子；

21、3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有90％以上的同一性且编码权利要求4所述蛋白质的核苷酸序列；

22、4)由seq id no.3所示的序列通过取代、缺失或增加核苷酸而获得的序列；

23、5)由seq id no.3所示的核苷酸序列产生不同的转录本或者同源基因序列。

24、基于薰衣草转录组分析以及不同发育时期组织的基因表达分析，筛选出具有共表达模式的一组基因，即latps7和lacyp71d582.经过系统进化树分析和蛋白注册结果表明，其参与萜的催化合成。遂将其核酸序列与表达载体重组后导入到受体微生物中，表达载体具体为pde2，受体微生物具体为大肠杆菌bl21(de3)，得到表达latps7蛋白质。lacyp71d582采用转基因烟草顺时表达，载体是super-1300-egfp，受体微生物是农杆菌gv3101。

25、还提供了latps7以gpp和/或npp为底物催化多种单萜物质的应用。

26、还提供了在所述编码基因在植物中催化产生柠檬烯和香芹醇的应用。在本发明具体的一个实施方案中，所述植物可以为烟草。

27、还提供了柠檬烯和香芹醇对在生物防治中的应用。

28、还提供了扩增所述编码基因的引物。

29、还提供了一种制备所述蛋白质方法，所述方法包括：将所述基因的核苷酸序列与表达载体重组后导入到受体微生物中，得到重组菌株，培养所述重组菌株，表达得到所述的蛋白质。

30、还提供了一种通过瞬时转化烟草，在烟草中表达目的蛋白的方法。将所述基因的核苷酸序列与表达载体重组后导入到受体微生物中，得到重组菌株，培养所述重组菌株，通过重组菌株浸染烟草植株获得蛋白。通过通过固相微萃取技术和气质联用(gc-ms)技术检测催化产物。

31、还提供了瞬时转化烟草对蚜虫和瓢虫趋避行为的影响，并用标准品进行了验证。

32、本发明首次克隆了薰衣草‘京薰2号’的柠檬烯合酶，首次克隆了薰衣草的cyp基因，并通过体外体内验证酶的催化产物，且进一步确立了酶催化产物对蚜虫和瓢虫的影响。这对薰衣草的分子育种，研究萜类的调控机理，以及精准开发环境友好型生物防治方法等方面均有重要意义。

技术特征：

1.薰衣草latps7蛋白，其为：

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在：所述基因为如下中至少一种：

4.薰衣草lacyp71d582蛋白，其为：

5.编码权利要求4所述蛋白的基因。

6.根据权利要求5所述的基因，其特征在：所述基因为如下中至少一种：

7.含有权利要求2或3所述基因和/或权利要求5或6所述基因的重组载体、表达盒、重组菌、重组细胞。

8.权利要求2或3所述的基因和/或权利要求5或6所述的基因在以gpp和/或npp为底物的情况下催化合成香芹醇中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，权利要求2或3所述的基因表达后产生的蛋白以gpp和/或npp为底物，催化合成单萜化合物，所述单萜化合物包含柠檬烯，进一步地，权利要求5或6所述的基因表达后产生的蛋白以所述的单萜化合物和/或柠檬烯为底物，催化合成香芹醇。

10.权利要求2或3所述的基因和/或权利要求5或6所述的基因在植物生物防治中的的应用，其特征在于，将权利要求2或3所述的基因和/或权利要求5或6所述的基因转入植物基因组中并在转基因植物中进行表达，使转基因植物中积累单萜化合物和/或香芹醇，从而对蚜虫进行驱避并吸引瓢虫。

技术总结
本发明涉及芳香植物分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及薰衣草LaTPS7及LaCYP71D582、编码基因及应用。本发明从自主培育的薰衣草‘京薰2号’的花萼腺毛中克隆到一个单萜合酶LaTPS7和一个细胞色素P450酶LaCYP71D582。实验结果表明，其催化产生的柠檬烯(limonene)和香芹醇(carveol)具有驱避蚜虫吸引瓢虫的功能，这对薰衣草精油成分的合成研究、薰衣草资源利用、研究植物单萜类调节机理等方面具有重要的理论和实际意义。

技术研发人员：石雷,凌正一,李慧,董燕梅,李靖锐,夏菲,白红彤
受保护的技术使用者：中国科学院植物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16