一种拟平滑念珠菌微卫星位点及其检测方法和应用

本发明涉及生物，具体地，涉及一种拟平滑念珠菌微卫星位点、一种拟平滑念珠菌微卫星位点的检测方法、一种用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组、一种用于检测拟平滑念珠菌微卫星位点的试剂盒、拟平滑念珠菌微卫星位点及其检测方法在拟平滑念珠菌的分子分型、分子溯源、院感监测、群体遗传和系统进化分析中的应用。

背景技术：

1、目前，用于拟平滑念珠菌主要分子标记为its和扩增片段长度多态性（aflp）标记等。但这些分子标记的种内多态性较低，无法满足对拟平滑念珠菌的菌株间亲缘关系鉴定、分子溯源、院感监测、群体遗传学等需要。

2、微卫星（microsatellite），又称简单重复序列（simple sequence repeats，ssr）或短串联重复序列（short tandem repeats，str），指基因组dna上的短的串联重复序列，重复单元一般为1-5bp，重复次数为5-40次。通过pcr检测重复区域的长度，可以进行遗传多态性分析。由于微卫星等位基因具有突变速率快的特点，因此该检测方法具有多态性高、特异性好、通量高、成本低等优点，并且在生物遗传作图、群体遗传研究、个体间亲缘关系鉴定等方面已得到广泛应用。然而，目前在病原体方面应用较少。

3、因此，提出种内高度多态性的微卫星位点分子标记及其检测方法具有重要的临床意义。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种高度多态性的拟平滑念珠菌微卫星位点、一种拟平滑念珠菌的微卫星位点的检测方法、一种用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组、一种用于检测拟平滑念珠菌的微卫星位点的试剂盒、拟平滑念珠菌微卫星位点及其检测方法在拟平滑念珠菌的分子分型、分子溯源、院感监测、群体遗传和系统进化分析中的应用。

2、为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种拟平滑念珠菌微卫星位点，该拟平滑念珠菌微卫星位点为核苷酸序列如seq id no.1-4所示的拟平滑念珠菌微卫星位点的组合。

3、另一方面，本发明提供了一种拟平滑念珠菌的微卫星位点的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

4、s1、提取拟平滑念珠菌的总dna；

5、s2、以所述总dna为模板，利用荧光标记的引物组在pcr反应体系中进行pcr扩增反应；

6、s3、对pcr扩增产物中的荧光标记dna片段进行多态性检测；

7、所述拟平滑念珠菌微卫星位点为本公开第一方面所述的拟平滑念珠菌微卫星位点；

8、所述引物组包含核苷酸序列如seq id no.5-8所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.9-12所示的反向引物。

9、可选地，每20μl的pcr反应体系中含有8-12μl的dna聚合酶、1-3μl的gdna、0.2-0.4μl的正向引物和0.2-0.4μl的反向引物；

10、所述正向引物的浓度为18-22μm，所述反向引物的浓度为18-22μm；

11、其中，所述正向引物的5’端通过荧光染料进行fam和/或hex标记。

12、可选地，步骤s2中，所述pcr扩增反应的反应程序包括：94℃ 5min，94℃ 30s，60℃40s，72℃ 50s，10个循环；94℃ 30s，53℃ 40s，72℃ 50s，27个循环；72℃ 10min。

13、可选地，所述多态性检测包括：利用毛细管电泳检测pcr扩增产物中的荧光标记dna片段，通过分子量内标确定所述pcr扩增产物的等位片段的位置和相对分子量。

14、具体过程包括：将分子量内标与甲酰胺以1：（90-110）的体积比混匀后，取15μl的混合物加入上样板中，再加入1μl稀释10倍的pcr产物。使用3730xl测序仪进行毛细管电泳，利用genemarker中的fragment（plant）片段分析软件对测序仪得到的原始数据进行分析，将各泳道内分子量内标与各pcr扩增产物峰值的位置做比较分析，得到片段大小。

15、另一方面，本发明提供了一种用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组，所述引物组包括核苷酸序列如seq id no.5-8所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.9-12所示的反向引物。

16、另一方面，本发明提供了一种用于检测拟平滑念珠菌微卫星位点的试剂盒，所述试剂盒中包含上述用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组。

17、另一方面，本发明提供了上述拟平滑念珠菌的微卫星位点以及拟平滑念珠菌微卫星位点的检测方法在拟平滑念珠菌的分子分型、分子溯源、院感监测、群体遗传和系统进化分析中的应用。

18、通过上述技术方案，本发明首次提供了拟平滑念珠菌微卫星位点、该拟平滑念珠菌微卫星位点的检测方法和特异性引物组，利用上述拟平滑念珠菌微卫星位点、检测方法以及特异性引物组进行拟平滑念珠菌的检测，具有多态性高、特异型好、通量高、成本低等优点，在拟平滑念珠菌分子流行病学、群体遗传研究等方面具有重要意义。

19、本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

技术特征：

1. 一种拟平滑念珠菌微卫星位点，其特征在于，所述拟平滑念珠菌微卫星位点为核苷酸序列如seq id no.1-4所示的拟平滑念珠菌微卫星位点的组合。

2.一种拟平滑念珠菌微卫星位点的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的检测方法，其中，每20μl的pcr反应体系中含有8-12μl的dna聚合酶、1-3μl的gdna、0.2-0.4μl的正向引物和0.2-0.4μl的反向引物；

4. 根据权利要求2所述的检测方法，其中，所述pcr扩增反应的反应程序包括：94℃5min，94℃ 30s，60℃ 40s，72℃ 50s，10个循环；94℃ 30s，53℃ 40s，72℃ 50s，27个循环；72℃ 10min；

5. 一种用于扩增权利要求1所述的拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组，其特征在于，所述引物组包括核苷酸序列如seq id no.5-8所示的正向引物和核苷酸序列如seq idno.9-12所示的反向引物。

6.一种用于检测权利要求1所述的拟平滑念珠菌微卫星位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含权利要求5所述的用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组。

7.权利要求1所述的拟平滑念珠菌微卫星位点和权利要求2-4中任一项所述的检测方法在拟平滑念珠菌的分子分型、分子溯源、院感监测、群体遗传和系统进化分析中的应用。

技术总结
本发明提供了一种拟平滑念珠菌微卫星位点、一种拟平滑念珠菌的微卫星位点的检测方法、一种用于扩增拟平滑念珠菌微卫星位点的引物组、一种用于检测拟平滑念珠菌的微卫星位点的试剂盒、拟平滑念珠菌微卫星位点及其检测方法在拟平滑念珠菌的分子分型、分子溯源、院感监测、群体遗传和系统进化分析中的应用。利用本发明提供的拟平滑念珠菌微卫星位点及其检测方法和特异性引物组对拟平滑念珠菌的型别进行检测，多态性高、特异型好，在拟平滑念珠菌分子流行病学、群体遗传研究等方面具有重要意义。

技术研发人员：张丽,徐英春,宁雅婷,肖盟,孙天舒,罗征宇,于淑颖,陆旻雅,康巍
受保护的技术使用者：中国医学科学院北京协和医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14