增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法

本发明属于合成生物学与生物，特别涉及核酸工程中的增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法。

背景技术：

1、人工核糖核酸工具(synthetic rna tools)在药学发现、疾病诊断和细胞重编程等领域中具有革命性的应用，其原理为模拟自然界中的基因调控，感应特定的细胞内分子作为输入，调节输出蛋白质的产生，从而对目标细胞进行靶向调控，其中有一类人工核糖核酸工具可以作为对胞内分子的检测。例如，saito及其合作者开发了合成核糖核酸分子开关(synthetic rna switches)，可检测模型蛋白(model proteins)与胞内微小核糖核酸(micrornas)。这些人工核糖核酸工具调控输出蛋白的功能基于对胞内分子的有效感应，其灵敏度是保证工具对目标细胞靶向性调控的关键，因此有必要进一步提高其灵敏度和增强检测的信号。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种有效增强胞内分子检测灵敏度的增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法。本发明的另一目的是提供一种人工核糖核酸工具对自身表达量形成正反馈，从而放大其报告蛋白因感应胞内分子造成的信号改变，提高细胞内分子检测灵敏度的增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法。

2、本发明的技术解决方案是所述增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法，其特殊之处在于，在转染入目标细胞后，在感应序列感应胞内分子的同时，通过正反馈的表达调控放大报告蛋白的表达信号，从而提高胞内分子检测的灵敏度；所述构建包括以下步骤：

3、(1)构建该人工核糖核酸工具的输出蛋白的开放阅读框序列；

4、(2)使用低表达量/弱5′端帽(five-prime cap)控制输出蛋白的基础表达量；

5、(3)构建该人工核糖核酸工具的非翻译区(untranslated regions)序列；其5′非翻译区(five prime untranslated region)中有适配体(aptamer)，可与开放阅读框表达的融合蛋白中核糖核酸结合蛋白域特异性结合；所述5′非翻译区或3′非翻译区中有分子感应序列(sensing sequence)，可特异性感应胞内分子，影响开放阅读框编码的输出蛋白的表达量。

6、作为优选：步骤⑴所述的开放阅读框序列，进一步包括：开放阅读框表达融合蛋白(fusion protein)，所述融合蛋白含有报告蛋白域(reporter protein domain)、核糖核酸结合蛋白域(rna binding protein domain)和vpg蛋白域(viral protein genome-linkeddomain)。

7、作为优选：所述步骤⑴进一步包括：

8、(1.1)报告蛋白域：报告蛋白域为可被检测的报告蛋白的序列；

9、(1.2)核糖核酸结合蛋白域为完整的模型核糖核酸结合蛋白序列，与所述人工核糖核酸工具分子通过非共价键的相互作用特异性结合；所述核糖核酸结合蛋白为外源蛋白，不与胞内原有蛋白组重叠；核糖核酸结合蛋白域与报告蛋白域的c端相接，根据融合蛋白的蛋白结构需求，决定是否采用连接序列相接；

10、(1.3)vpg蛋白域：vpg蛋白域用于与胞内翻译起动因子(translation initiationfactors)结合启动翻译；vpg蛋白域直接与核糖核酸结合蛋白域的c端相接。

11、作为优选：所述步骤(2)进一步包括对低表达量/弱5′端帽的使用：

12、所述弱5′端帽于人工核糖核酸工具合成时被添加到5′端以保护人工信使核糖核酸的稳定性；不同于自然的5′端帽，所述人工5′端帽应有较弱的胞内翻译启动因子募集能力，从而使该人工核糖核酸工具的胞内基础表达量在一个较低的水平，通常使用gpppa cap(acap)。

13、作为优选：所述步骤(3)进一步包括：

14、(3.1)5′非翻译区中的适配体与输出蛋白中的核糖核酸结合蛋白域的通过非共价键的特异性结合；

15、(3.2)5′非翻译区或3′非翻译区的胞内分子感应序列(sensing sequence)构建；5′非翻译区或3′非翻译区中插入目标微小核糖核酸反向互补序列，该序列的位置与拷贝数于具体实施时再进行优化。

16、作为优选：所述人工核糖核酸工具与对照报告蛋白同时转染入目标细胞后，通过对报告蛋白表达量的检测，以对照报告蛋白作为标准进行校正标准化，即可有效反映在不同细胞中，目标胞内分子的含量高低。

17、本发明的另一技术解决方案是所述增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法，其特殊之处在于，构建正反馈的核糖核酸表达调控，从而提高胞内分子检测的灵敏度；弱5′端帽使得所述人工核糖核酸工具分子的表达量处于低水平；所述人工核糖核酸工具转染入细胞后，在不存在目标微小核糖核酸的理想情况下，所述人工核糖核酸工具分子以低基础表达水平表达输出蛋白；核糖核酸结合蛋白域特异性结合到5′非翻译区中的适配体上，从而输出蛋白中的vpg蛋白域作用于人工核糖核酸工具分子，募集翻译启动因子，提高输出蛋白的表达量；而表达的输出蛋白进一步作用于未被启动的人工核糖核酸工具分子，进一步提高输出蛋白的表达量；而被正反馈表达调控后，输出蛋白的报告蛋白域则提供已经放大的信号检测；在胞内存在目标微小核糖核酸时，所述人工核糖核酸工具分子在原有低基础表达的情况下再被抑制，而所述人工核糖核酸工具分子也在被抑制的过程中受胞内核糖核酸机制影响降解，大幅降低正反馈表达调控带来的检测效果，从而提高在不同核糖核酸含量情况的检测灵敏度。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果:

19、⑴本发明核糖核酸在拥有可以感应胞内分子的序列的基础上，使用了较弱的5′端帽，使得其基础表达量较低；报告蛋白融合了报告蛋白域、核糖核酸结合蛋白域和vpg蛋白域，核糖核酸在表达过程中可以实现正反馈的表达调控：

20、⑵本发明报告蛋白一方面可以提供检测信号，另一方面其核糖核酸结合蛋白域和vpg蛋白域会再作用于该核糖核酸上，进一步增强其表达，从而报告蛋白的信号可以有效地被放大，所以报告蛋白的表达量随胞内分子的浓度影响也会随之放大，利用该核糖核酸工具可以达到提高胞内分子检测灵敏度的效果。

21、⑶本发明的实施例中，在相同浓度的mir-21mimic的情况下，模型人工核糖核酸工具比阴性对照显著有更大由mir-21导致的信号变化，表明本发明的人工核糖核酸工具可有效增强胞内分子的检测灵敏度。

技术特征：

1.一种增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法，其特征在于，在转染入目标细胞后，在感应序列感应胞内分子的同时，通过正反馈的表达调控放大报告蛋白的表达信号，从而提高胞内分子检测的灵敏度；所述构建方法，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法，其特征在于，步骤⑴所述的开放阅读框序列，进一步包括：开放阅读框表达融合蛋白(fusionprotein)，所述融合蛋白含有报告蛋白域(reporter protein domain)、核糖核酸结合蛋白域(rna binding protein domain)和vpg蛋白域(viral protein genome-linkeddomain)。

3.根据权利要求1或2所述增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法，其特征在于，所述步骤⑴进一步包括：

4.根据权利要求1所述增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法，其特征在于，所述步骤⑵进一步包括对低表达量/弱5′端帽的使用：

5.根据权利要求1所述增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法，其特征在于，所述步骤⑶进一步包括：

6.根据权利要求4所述增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法，其特征在于，所述人工核糖核酸工具与对照报告蛋白同时转染入目标细胞后，通过对报告蛋白表达量的检测，以对照报告蛋白作为标准进行校正标准化，即可有效反映在不同细胞中，目标胞内分子的含量高低。

7.一种增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具，其特征在于，构建正反馈的核糖核酸表达调控，从而提高胞内分子检测的灵敏度；弱5′端帽使得所述人工核糖核酸工具分子的表达量处于低水平；所述人工核糖核酸工具转染入细胞后，在不存在目标微小核糖核酸的理想情况下，所述人工核糖核酸工具分子以低基础表达水平表达输出蛋白；核糖核酸结合蛋白域特异性结合到5′非翻译区中的适配体上，从而输出蛋白中的vpg蛋白域作用于人工核糖核酸工具分子，募集翻译启动因子，提高输出蛋白的表达量；而表达的输出蛋白进一步作用于未被启动的人工核糖核酸工具分子，进一步提高输出蛋白的表达量；而被正反馈表达调控后，输出蛋白的报告蛋白域则提供已经放大的信号检测；在胞内存在目标微小核糖核酸时，所述人工核糖核酸工具分子在原有低基础表达的情况下再被抑制，而所述人工核糖核酸工具分子也在被抑制的过程中受胞内核糖核酸机制影响降解，大幅降低正反馈表达调控带来的检测效果，从而提高在不同核糖核酸含量情况的检测灵敏度。

技术总结
本发明涉及增强胞内分子检测灵敏度的人工核糖核酸工具的构建方法。包括：⑴构建该人工核糖核酸工具的输出蛋白的开放阅读框序列；开放阅读框可表达融合蛋白，融合蛋白含有报告蛋白域、核糖核酸结合蛋白域和VPg蛋白域；(2)使用低表达量/弱5′端帽控制输出蛋白的基础表达量；(3)构建该人工核糖核酸工具的非翻译区序列；5′非翻译区中有适配体，与开放阅读框表达的融合蛋白中核糖核酸结合蛋白域特异性结合；其5′非翻译区或3′非翻译区中有分子感应序列，可特异性感应胞内分子，影响开放阅读框编码的输出蛋白的表达量。

技术研发人员：旷怡,梁正桦,谭开鑫
受保护的技术使用者：香港科技大学深圳研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15