一种用于体外转染mRNA的脂质试剂及其制备工艺的制作方法

本发明涉及体外转染的，尤其是涉及一种用于体外转染mrna的脂质试剂及其制备工艺。

背景技术：

1、随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。并且受到近期mrna领域研究热度影响，对转染的要求进一步提高。

2、外源基因转染入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂，而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用阳离子脂质体法。

3、阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将dna分子包裹入内，形成dna脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。

4、目前，市面上的脂质试剂或存在毒性较强、或存在转染效果差、或存在重复性较差等问题，亟待研究一款毒性低、转染效果优异及重复性强的产品。

技术实现思路

1、基于上述缺陷，本发明公开了一种用于体外转染mrna的脂质试剂及其制备工艺，该脂质试剂毒性低、转染效果优异、重复性强；该制备工艺稳定性较强，可保证样品批次间的一致性，确保转染试验较高的可重复性。

2、第一方面，本发明提供了一种用于体外转染mrna的脂质试剂，采用如下技术方案：一种用于体外转染mrna的脂质试剂，包括第一阳离子脂质、第二阳离子脂质与辅助脂质；所述第一阳离子脂质与第二阳离子脂质的摩尔比例为1:(0.25-1.5)。

3、本发明采用第一阳离子脂质、第二阳离子脂质与辅助脂质复配形成脂质试剂，将该脂质试剂应用在体外转染领域中，在本领域算是新的尝试；并且第一阳离子脂质与第二阳离子脂质混合摩尔比适中，通过第一阳离子脂质、第二阳离子脂质相互补充，明显地提高了转染效果，同时，该脂质试剂毒性低，重复性强。

4、作为优选，所述第一阳离子脂质与第二阳离子脂质总和与辅助脂质的摩尔比例为1:(0.1-1)。

5、通过采用上述技术方案，超出上述摩尔比例范围，会明显减弱转染效果。

6、作为优选，所述辅助脂质包括dope、dopc、dspe、dspc中至少一种。

7、通过采用上述技术方案，上述辅助脂质具有较强的协同作用，辅助阳离子脂质稳定双层膜和降低阳离子脂质的毒性，从而有助于保证脂质试剂高转染以及低毒性。

8、第二方面，本发明提供了一种用于体外转染mrna的脂质试剂的制备工艺，采用如下技术方案：

9、一种用于体外转染mrna的脂质试剂的制备工艺，包括如下步骤：

10、将第一阳离子脂质、第二阳离子脂质与辅助脂质溶于乙醇中作为乙醇相溶液；

11、调配水相溶液至酸性；

12、将乙醇相溶液与水相溶液混匀；

13、调整摩尔浓度至1～10mm，得脂质试剂。

14、通过采用上述技术方案，本发明脂质成分采用第一阳离子脂质、第二阳离子脂质复配，将水相溶液调配至酸性，再将乙醇相溶液与水相溶液混合，摩尔浓度调至1～10mm，制得本发明的脂质试剂，制备工艺稳定性强，可保证样品批次间的一致性，确保转染试验的可重复性。

15、作为优选，乙醇相溶液的摩尔浓度为5～20mm。

16、本发明的脂质乙醇相溶液是三种脂质混合，在一些具体的实施方式中，乙醇相溶液的摩尔浓度为5～20mm，有利于保证批次间的稳定性。

17、如果超出上述范围，不但影响批次间稳定性，还会影响样品的均一性。

18、作为优选，水相溶液采用5～100mm的柠檬酸或者醋酸缓冲液，ph为3～6。

19、通过采用上述技术方案，柠檬酸或者醋酸缓冲液，

20、扩大专利保护范围，醋酸缓冲液更具优势。

21、作为优选，乙醇相溶液与水相溶液以微流控技术进行混匀，混匀总流速为10～15ml/min，流速比为1：(0.5～3)。

22、通过采用上述技术方案，上述总流速与流速比条件下，乙醇相溶液与水相溶液混匀效率与均一性最佳，所制备的脂质试剂具有优异的转染效果。

23、作为优选，采用ph为3～6的醋酸或者柠檬酸缓冲液调整摩尔浓度至3mm。

24、通过采用上述技术方案，利用醋酸或者柠檬酸作为调整摩尔浓度的缓冲液，有助于保证体系中成分单一，减少引入其他杂离子，进而保证后续转染效果。

25、作为优选，混匀后的样品经过中空纤维柱切向流过滤方式除去乙醇。

26、通过采用上述技术方案，采用中空纤维柱切向流过滤方式去除乙醇，此步骤为浓度调整。是否换液去除样品中乙醇为可选项。去除去样品中乙醇会提高样品转染效果减低毒性。

27、第三方面，本发明提供了一种用于体外转染mrna的脂质试剂的转染方法，采用如下技术方案：

28、一种用于体外转染mrna的脂质试剂的转染方法，包括如下步骤：

29、转染试剂与待转染mrna直接混匀孵育3～7min，加入细胞培养液中培养3～5h，培养3～5h后更换培养液即可完成转染操作。

30、通过采用上述技术方案，直接利用转染试剂与待转染的mrna混匀，孵育3～7min即可，而现有技术中是将转染试剂、待转染mrna分别与dmem培养基混匀孵育5min，再将两部分混合液混合静置5min，本发明与现有技术相比，制样效率提升显著，进而提高转染效率。

31、本发明至少具有以下有益效果：

32、1、本发明的脂质组分采用第一阳离子脂质、第二阳离子脂质与辅助脂质以特定摩尔比复配，制备的脂质试剂毒性低、高转染、可重复性强；

33、2、本发明的制备工艺，工艺稳定性极强，可保证样品批次间一致，确保转染实验可重复；

34、3、本发明的转染过程，操作便捷，转染试剂与待转染的mrna直接混匀即可进行细胞转染。

技术特征：

1.一种用于体外转染mrna的脂质试剂，其特征在于：包括第一阳离子脂质、第二阳离子脂质与辅助脂质；所述第一阳离子脂质与第二阳离子脂质的摩尔比例为1:(0.25-1.5)。

2.根据权利要求1所述的一种用于体外转染mrna的脂质试剂，其特征在于：所述第一阳离子脂质与第二阳离子脂质总和与辅助脂质的摩尔比例为1:(0.1-1)。

3.根据权利要求1所述的一种用于体外转染mrna的脂质试剂，其特征在于：所述辅助脂质包括dope、dopc、dspe、dspc中至少一种。

4.如权利要求1~3任意一项所述的一种用于体外转染mrna的脂质试剂的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的一种用于体外转染mrna的脂质试剂的制备工艺，其特征在于：水相溶液采用5~100mm的柠檬酸或者醋酸缓冲液，ph为3~6。

6.根据权利要求4所述的一种用于体外转染mrna的脂质试剂的制备工艺，其特征在于：乙醇相溶液与水相溶液以微流控技术进行混匀，混匀总流速为10~15ml/min，流速比为1：(0.5~3)。

7.根据权利要求4所述的一种用于体外转染mrna的脂质试剂的制备工艺，其特征在于：采用ph为3~6的醋酸或者柠檬酸缓冲液调整摩尔浓度至3mm。

8.根据权利要求4所述的一种用于体外转染mrna的脂质试剂的制备工艺，其特征在于：混匀后的样品经过中空纤维柱切向流过滤方式除去乙醇。

9.采用权利要求1~3任意一项所述的一种用于体外转染mrna的脂质试剂的转染方法，其特征在于，包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种用于体外转染mRNA的脂质试剂及其制备工艺，该脂质试剂包括第一阳离子脂质、第二阳离子脂质与辅助脂质；所述第一阳离子脂质与第二阳离子脂质的摩尔比例为1:(0.25‑1.5)；本发明采用第一阳离子脂质、第二阳离子脂质与辅助脂质复配形成脂质试剂，将该脂质试剂应用在体外转染领域中，在本领域算是新的尝试；并且第一阳离子脂质与第二阳离子脂质混合摩尔比适中，通过第一阳离子脂质、第二阳离子脂质相互补充，明显地提高了转染效果，同时，该脂质试剂毒性低，重复性强。

技术研发人员：肖潇,马正耕,吴景浩,王封良
受保护的技术使用者：江苏申基生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14