一种抗HBP单克隆抗体的制备方法、单克隆抗体及应用与流程

本发明属于单克隆抗体制备，具体是一种抗肝素结合蛋白的单克隆抗体、单克隆抗体及其应用。

背景技术：

1、肝素结合蛋白（hbp）是存在于中性粒细胞中的蛋白质，由shafer教授在1984年发现并分离成功。由于当时测得的相对分子质量为37000，因此将其命名为cap37（cationicantimicrobial protein of 37000）。后来学者又从嗜苯胺蓝颗粒中分离出具有杀菌活性的嗜苯胺蓝蛋白，命名为azurocidin，即天青杀素。再后来发现其具有极强的肝素结合能力，因此命名为肝素结合蛋白（heparin-bindin protein，hbp）。

2、肝素结合蛋白是细菌感染最早升高的标志物，当发生感染时，细菌侵入血管内，刺激中性粒细胞释放hbp，血浆中hbp含量升高。与其他传统感染指标如pct、crp、il-6、白细胞数量等相比，hbp的感染变化出现早，灵敏度、特异性、阳性和阴性检出率等综合指征显著优于其他感染指标。动态监测血浆hbp浓度，可用于评估脓毒症的严重程度，预测严重感染患者休克风险、脓毒症患者心搏骤停风险等。对临床细菌感染性疾病尽早诊断和治疗具有重要指示意义。

3、hbp的检测方法主要为免疫荧光法，定量检测。该方法学具有操作过程简单、报告结果时间短等优势，应用于各个临床科室可有效提高检测效率，特别对于危重症患者，可有效缩短样本流转时间，尽快帮助临床医生了解患者病情。但是目前市场普遍反馈准确度较低，根本原因就是作为试剂开发的原料，单克隆抗体的特异性较差，本底信号较高，导致临床符合率较差。所以，开发高性能的抗hbp单克隆抗体尤为重要。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一；为此，本发明提出了一种抗肝素结合蛋白的单克隆抗体。

2、一种抗hbp单克隆抗体的制备方法，该方法具体包括如下步骤：

3、制备抗hbp的单克隆抗体，具体为：

4、（1）动物免疫：以hbp蛋白作为抗原，与等量的福氏完全佐剂充分乳化后，经皮下注射免疫兔子，以两周时间间隔进行加强免疫3次，末次加强免疫后5-8d 后经兔子静脉取血，用elisa法检测血清效价，血清效价达到＞128k的标准后，进行外周血单个核细胞（pbmc）悬液的制备；

5、（2）pbmc制备：在离心管中加入淋巴细胞分离液ficoll，取抗凝外周血（全血）与无菌pbs按照1:1-1:5充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，水平离心400g×30分钟，离心后去除部分上层液体，余下约1ml，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞；置入另一离心管中，加入5倍以上体积的pbs，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次；末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，加入10mlpbs，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次；弃上清，加入含有10%fbs的rpmi1640，重悬细胞，计数；

6、（3）获取单个b细胞：利用制备好的pbmc，通过对抗原标记，使用流式分选设备进行细胞分选获得具有抗原特异性的b细胞；通过对目标b细胞的基因扩增，获取抗体的轻重链基因序列。

7、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

8、本发明以hbp真核重组蛋白作为免疫原，通过免疫兔子，对兔子的pbmc进行细胞分选，获取特异性结合免疫原的细胞，然后对抗体进行基因扩增获取抗体的轻重链基因序列，通过后续的细胞重组表达获取高纯度和高亲和力的兔单克隆抗体，本发明涉及的单克隆抗体作为诊断用的重要原料，可以特异性结合天然样本中的hbp蛋白，具有较高的临床符合率，对于临床细菌性感染性疾病的早期诊断与治疗具有重要指示意义。

技术特征：

1.一种抗hbp的单克隆抗体，其特征在于，其包含重链全长氨基酸序列seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7，和轻链全长氨基酸序列seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8。

2.一种如权利要求1所述的抗hbp的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种抗hbp单克隆抗体的制备方法，其特征在于，在制备完制备抗hbp的单克隆抗体后还需对抗hbp单克隆抗体重轻链基因序列进行获取，具体方式为：

4.根据权利要求2所述的一种抗hbp单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法还包括对抗hbp单克隆抗体的表达、纯化，具体方式为：

5.一种制备抗hbp的单克隆抗体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用了权利要求2-4任一项所述制备方法制备得到的单克隆抗体、或者所述试剂盒中含有权利要求1所述的单克隆抗体。

技术总结
本发明涉及一种抗HBP单克隆抗体的制备方法、单克隆抗体及应用。本发明以HBP真核重组蛋白作为免疫原，通过免疫兔子，对兔子的PBMC进行细胞分选，获取特异性结合免疫原的细胞，然后对抗体进行基因扩增获取抗体的轻重链基因序列，通过后续的细胞重组表达获取高纯度和高亲和力的单克隆抗体。本发明涉及的单克隆抗体作为诊断用的重要原料，可以特异性结合天然样本中的HBP蛋白，具有较高的临床符合率，对于临床细菌性感染性疾病的早期诊断与治疗具有重要指示意义。

技术研发人员：董万春,邓卉,高歌
受保护的技术使用者：南京欧凯生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14