一种高产四甲基吡嗪的菌株及碳源优化固态发酵培养基的方法与流程

本发明涉及菌株发酵，尤其涉及一种高产四甲基吡嗪的菌株及碳源优化固态发酵培养基的方法。

背景技术：

1、烷基吡嗪是一组杂环含氮化合物，在生食和加工食品以及酒精饮料中普遍存在。它们通常被认为是重要的香气化合物，具有坚果味、烤味和烤面包味的风味。2，3，5，6-四甲基吡嗪(ttmp)是一种常见的烷基吡嗪，已发现这种化合物是东方食品的特征气味的原因。它广泛存在于生食，加工食品和酒精饮料中。ttmp除了作为食品中的风味添加剂外，还具有很高的保健价值。它可以扩张血管，抑制血小板聚集，改善微循环，增加冠状动脉和脑血流量，是临床常用的抗血小板药物。它可以预防各种疾病，如心血管和脑血管疾病，缺血性中风，癌症和糖尿病。因此，ttmp不仅对中国白酒的风味有重大贡献，而且赋予其保健功能。

2、迄今为止，已经建立了许多通过美拉德反应和strecker降解合成吡嗪的方法，但是与“天然”或“生物”产品相比，化学介质的参与导致“人工”标签不太受重视。从l.wallichii植物直接提取ttmp通常与作为最终产品的ttmp浓度低(约0.075％，wt/wt)，底物来源的可用性有限以及提取成本高有关，所有这些都阻碍了ttmp的工业规模加工。这两种方法的缺点加上对天然产物的兴趣日益浓厚，表明吡嗪的生物技术生产是一种有前途和有效的方法。

3、芽孢杆菌是具有许多制药和化工用途的重要工业微生物，包括其用于生产工业酶(蛋白酶、α-淀粉酶和青霉素酶)、肽抗生素(杆菌肽和蛋白酶肽)以及高附加值化学品(柠檬酸、肌苷和肌苷酸)。此外芽孢杆菌是酿造过程中的优势细菌，已被鉴定为影响酱香型白酒酿造工艺和风味的主要菌种之一。主要是其具有产吡嗪类化合物的作用。但大多数芽孢杆菌的四甲基吡嗪合成能力不高。因此，为了提高四甲基吡嗪合成能力以应用在酿酒等领域，亟需提供一种高产四甲基吡嗪的菌株及固态发酵方法。

技术实现思路

1、本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种高产四甲基吡嗪的菌株及碳源优化固态发酵培养基的方法。本发明将植物贝莱斯芽孢杆菌yb26在特定麸皮固态培养基上进行培养，能够显著提高贝莱斯芽孢杆菌yb26四甲基吡嗪的产量。为了进一步提高贝莱斯芽孢杆菌yb26的ttmp的产量对固态培养基中的碳源进行优化。

2、本发明是通过以下技术方案实现的：

3、一株高产四甲基吡嗪的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)yb26，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为：2023年6月2日，保藏编号为cgmcc no27531。

4、一种贝莱斯芽孢杆菌yb26固态发酵的培养基，以水为溶剂，包括以下组分：麸皮，豆粕粉。为了进一步提高贝莱斯芽孢杆菌yb26的固态培养基的ttmp的含量对培养基中的碳源组分进行优化。

5、一种碳源优化贝莱斯芽孢杆菌yb26固态发酵培养基的方法，所述的麸皮、豆粕粉按照一定比例混合均匀后加入定量的水，每50g装入250ml锥形瓶中。

6、所述的麸皮、豆粕粉和不同种类的碳源按照一定比例混合均匀后加入定量的水，每50g装入250ml锥形瓶中，所述的碳源包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、糊精。

7、具体包括如下步骤：

8、(1)将存放在曲房的曲块分5个取样点随机进行采收，并粉碎过筛待用；

9、(2)将取粉碎后的曲粉，置于lb液体培养基中，富集培养；

10、(3)将富集培养后的样品稀释涂布于lb固体培养基中，培养箱过夜培养分离单菌落；

11、(4)将常温分离得到的单菌落菌株，分批制成种子液涂布于lb固体培养基上过夜高温培养分离单菌落；

12、(5)将纯化的菌种分别接入vp液体培养基(voges-proskauer(v-p)培养基)：葡萄糖5g/l，蛋白胨5g/l，氯化钠g/l，ph7.2，121℃灭菌20min。

13、中，摇床培养；

14、(6)将培养液加o’meara试剂(含0.3％肌酸的40％naoh溶液)，摇动均匀，静置于恒温箱培养；

15、(7)将培养结束的培养液置于分光光度计中测吸光值；

16、(8)将具有较高吸光值的菌株接种于含液态发酵培养基，过夜培养；

17、(9)取培养液离心，收集上清液，过水相滤膜，取过滤样品于样品瓶中，hplc法测定样品中ttmp含量，选出产ttmp较高的菌株进行固态发酵复筛；

18、(10)将液态发酵高产ttmp的功能菌单菌落接种至液态发酵培养基的摇瓶中，过夜培养；

19、(11)将液态发酵培养液作为种子液，接入麸皮固态培养基中，培养一段时间后，通过hplc定性分析筛选获得微生物菌株；

20、(12)向固体麸皮培养基中加入不同碳源；

21、(13)将液态发酵培养液作为种子液，接入麸皮固态培养基中，培养一段时间后，通过hplc定性分析筛选获得微生物菌株；

22、(14)培养一段时间后，称取适量培养物，烘干至恒重，计算固态发酵培养基发酵后的含水量；

23、(15)取发酵后的麸皮固态培养物，加入50ml 40％乙醇，超声波超声1h；

24、(16)取上清液过有机滤膜，供hplc检测，通过hplc定性分析筛选获得微生物菌株高产ttmp的最佳碳源。

25、步骤(1)中筛孔为100目，步骤(2)中富集培养时间为1h。

26、步骤(3)中所述的过夜培养是常温37℃培养24h；步骤(4)中所述的过夜高温培养是高温50℃培养48h；步骤(5)中所述的vp液体培养基的od值为0.15～1.08。步骤(8)中所述的过夜培养是常温37℃培养48h。

27、所筛选菌株液态发酵产ttmp的量在0.20～3.95mg/l；所筛选菌株固态发酵产ttmp的量在0.26～1.72mg/g。

28、所筛选菌株固态发酵产ttmp最高菌株yb26最佳碳源为蔗糖。

29、菌株yb26在添加了蔗糖的培养基中ttmp的产量最高为4.11mg/g。

30、本发明的优点是：本发明将菌株在固态麸皮培养基上进行固态发酵培养，筛选出一株在固态麸皮发酵培养基中产ttmp的能力较高的菌株，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，将其命名为贝莱斯芽孢杆菌yb26。优化培养基中的碳源组分，筛选出最佳碳源为蔗糖，添加了蔗糖的固态麸皮培养基显著提高了贝莱斯芽孢杆菌yb26产ttmp的量，产量高达4.11mg/g，显著提高了该菌株生成ttmp的量。

技术特征：

1.一株高产四甲基吡嗪的贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）yb26，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为：2023年6月2日，保藏编号为cgmcc no27531。

2.一种贝莱斯芽孢杆菌yb26固态发酵的培养基，其特征在于：以水为溶剂，包括以下组分：麸皮，豆粕粉。

3.一种碳源优化权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌yb26固态发酵培养基的方法，其特征在于：所述的麸皮、豆粕粉按照一定比例混合均匀后加入定量的水，每50 g装入250 ml锥形瓶中。

4.根据权利要求3所述的一种碳源优化贝莱斯芽孢杆菌yb26固态发酵培养基的方法，其特征在于：所述的麸皮、豆粕粉和不同种类的碳源按照一定比例混合均匀后加入定量的水，每50 g装入250 ml锥形瓶中，所述的碳源包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖、糊精。

5.根据权利要求4所述一种碳源优化贝莱斯芽孢杆菌yb26固态发酵培养基的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的一种碳源优化贝莱斯芽孢杆菌yb26固态发酵培养基的方法，其特征在于：步骤（1）中筛孔为100目，步骤（2）中富集培养时间为1h。

7.根据权利要求5所述的一种碳源优化贝莱斯芽孢杆菌yb26固态发酵培养基的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的过夜培养是常温37℃培养24h；步骤（4）中所述的过夜高温培养是高温50℃培养48h；步骤（5）中所述的vp液体培养基的od值为0.15~1.08；步骤（8）中所述的过夜培养是常温37℃培养48h。

8.根据权利要求5所述的一种碳源优化贝莱斯芽孢杆菌yb26固态发酵培养基的方法，其特征在于：所筛选菌株液态发酵产ttmp的量在0.20~3.95 mg/l；所筛选菌株固态发酵产ttmp的量在0.26~1.72 mg/g。

9.根据权利要求8所述的一种碳源优化贝莱斯芽孢杆菌yb26固态发酵培养基的方法，其特征在于： 所筛选菌株固态发酵产ttmp最高菌株yb26最佳碳源为蔗糖。

10.根据权利要求9所述的一种碳源优化贝莱斯芽孢杆菌yb26固态发酵培养基的方法，其特征在于：菌株yb26在添加了蔗糖的培养基中ttmp的产量最高为4.11 mg/g。

技术总结
本发明公开了一种高产四甲基吡嗪的菌株及碳源优化固态发酵培养基的方法，显著提高了该菌株四甲基吡嗪的产量，属于发酵技术领域。本发明的贝莱丝芽孢杆菌（Bacillus velezensis）YB26，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为：2023年6月2日，保藏编号为CGMCC No 27531。本发明分别在液态、固态培养基中发酵筛选高产四甲基吡嗪菌株，贝莱丝芽孢杆菌YB26在固态培养基中产四甲基吡嗪的量显著高于其他菌株，为高产四甲基吡嗪菌株。将固态发酵培养基中的碳源进一步优化，得到蔗糖能够显著提高贝莱丝芽孢杆菌YB26在固态培养基中四甲基吡嗪的产量，该产量在固态发酵中已报道最高水平。

技术研发人员：徐钦祥,曾化伟,李志强,孟卫东,刘恒兆,赵颖,陈路露,单淑芳,颛孙皖皖
受保护的技术使用者：安徽口子酒业股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16