一种经血源子宫内膜干细胞中Muse细胞的分离培养方法及应用

本发明涉及细胞工程，具体涉及一种经血源子宫内膜干细胞中muse细胞的分离培养方法及应用。

背景技术：

1、多系分化应激耐受（multilineage-differentiating stress-enduring，muse）细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能、可向3个胚层分化的细胞，并且具有非致瘤性和低端粒酶活性，是组织工程、细胞移植及基因治疗领域的理想种子细胞，为临床上多种疾病的治疗提供了广阔的前景。目前已有报道从脐带、骨髓和脂肪组织中成功分离出muse 细胞。muse细胞在骨髓、皮肤、脂肪等各类组织中含量较低，约为万分之几。而在间充质干细胞中含量约为百分之几。因此可以通过从各类间充质干细胞中分离培养出muse细胞进行研究和疾病治疗。

2、目前还没有muse细胞治疗小鼠急性肝损伤和大鼠脑出血的案例及指导。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供一种经血源子宫内膜干细胞中muse细胞的分离培养方法及应用，从经血中提取出了能够应用于脑出血治疗以及急性肝损伤治疗的muse细胞，且在脑出血的治疗当中构建了相应的用来观测评估muse细胞改善脑出血的模型。

2、为解决上述技术问题，本发明提供一种经血源子宫内膜干细胞中muse细胞的分离培养方法，所述muse细胞由经血源子宫内膜干细胞的样本中分离和培养，该muse细胞鉴定后验证了具有cd105和sseea3阳性表达。

3、本发明相较于脐带、骨髓和脂肪中提取muse细胞，从经血源子宫内膜干细胞的样本即：经血中进行提取，样本来源广泛，可周期性获取，采集简单无侵入性和创伤性，从中分离培养经血源子宫内膜干细胞的方法简单快速，因此经血源子宫内膜干细胞是非常理想的基础科研或临床用种子细胞。

4、进一步的，所述分离培养方法包括以下步骤：

5、s1、贴壁培养经血源子宫内膜干细胞至p3-p6代次，得到贴壁细胞，收集贴壁细胞进行重悬处理，得到细胞悬液，对细胞悬液转移后进行富集处理，得到所需muse细胞；

6、s2、检测含量，使用流式细胞术检测muse细胞的含量；

7、如图1所示，随着胰酶处理时间的增加，细胞存活力下降。如图2所示，胰酶处理8h的细胞悬液在悬浮培养条件下，muse细胞可形成球形细胞簇，将细胞簇贴壁培养，muse细胞逐渐爬出。如图3所示，在经血源子宫内膜干细胞中成功收集到了表达cd105和ssea3的muse细胞。

8、进一步的，所述重悬处理采用胰酶进行重悬，每1.5*106细胞使用5ml的胰酶进行重悬。

9、进一步的，所述富集处理的环境温度为37℃，co2浓度为5%，富集处理的时间为8h。

10、进一步的，所述悬浮培养介质经过甲基丙烯酸2-羟乙酯处理，且对所述细胞悬液中添加甲基纤维素；

11、处理方式为11.4ml 99.7%的乙醇加入0.6ml无菌超纯水，配置成95%乙醇溶液。将360mg的甲基丙烯酸2-羟乙酯溶于上述95%乙醇溶液中，加到培养皿中过夜晾干；

12、甲基纤维素的添加步骤如下：

13、（1）配置含有15%fbs的dmem培养基，加入贴壁细胞并调节细胞悬液浓度为1*104细胞/ ml；

14、（2）加入甲基纤维素使得fbs在添加了贴壁细胞的dmem培养基中最终浓度为10%，得到含有甲基纤维素的细胞悬液；

15、（3）将含有甲基纤维素的细胞悬液充分混匀后加入到处理过的24孔培养皿中，每3天每孔添加300μl含有10%fbs的dmem。

16、本发明的另一目的在于提供一种多系分化耐受细胞在脑出血中的应用，所述多系分化耐受细胞为上述分离培养方法所提取到的muse细胞。

17、本发明成功地将menscs来源的muse细胞应用于脑出血疾病，如图5和图6所示，从menscs中提取出的muse细胞确实迁移至了具有炎症因子的大鼠血清中，且对比于正常组和menscs组，迁移数量更多，有效的证明了muse细胞能够对脑出血做出响应。

18、进一步的，所述脑出血的模型为大鼠ich模型。

19、进一步的，所述大鼠ich模型的构建方式包括以下步骤：

20、s1、造模前准备，对大鼠进行禁食不禁水12h后进行麻醉；

21、s2、造模，进行脑立体定位注射手术：以大鼠前囟为原点，调整坐标x=0，y=0。调平后，移动针头到目的坐标颅骨表面前囟的右侧3.0 mm，前方0.5 mm，用颅骨钻钻孔。当针头下降至颅骨表面时，z轴坐标调为0mm，缓慢下针到-5.87mm，颅骨厚度0.37mm，进行药物注射，在位于大鼠右侧脑str区以0.2μl/min速度注射1μl ⅶ型胶原酶，留针10min后缓慢拔针并缝合皮肤伤口完成ich大鼠模型的构建；

22、s3、模型的检测，按照mnss的标准对大鼠进行评分，分值达到4分或4分以上时脑出血造模成功。

23、本发明还对构建了脑出血模型的大鼠进行了相关测试，并对受到muse细胞注射治疗的大鼠也进行了测试，如图7、图8和图9显示，ich大鼠经过muse细胞移植治疗后，muse细胞可以有效归巢到受损区域，大鼠的运动能力得到了改善，神经损伤也得到了修复，极大的促进了脑出血治疗方法相关研究进程，提供的脑出血模型也能加快相关领域的研究进程。

24、本发明的另一目的在于提供一种多系分化应激耐受细胞在急性肝损伤中的应用，所述多系分化应激耐受细胞为上述分离培养方法所提取到的muse细胞。

25、本发明成功将menscs来源的muse细胞应用于急性肝损伤疾病，体外评估了muse细胞和menscs在正常组和肝损伤组血清中的迁移情况，如图10和图11所示，muse细胞向肝损伤小鼠来源血清中的迁移能力优于menscs，说明muse细胞具有更好的炎症响应和归巢效果。体内研究发现muse细胞经静脉移植后能够到达肝损伤区域（图12），通过对肝功能检测指标谷丙转氨酶（gpt）和谷草转氨酶（got）的检测，经muse细胞治疗后的血清中gpt和got水平有所降低，这说明muse细胞静脉注射治疗能够有效缓解肝损伤（图13和图14），并且治疗效果优于menscs，是更理想的肝损伤疾病治疗细胞。

26、进一步的，所述多系分化细胞通过静脉移植对脑出血部位进行修复，所述多系分化细胞的细胞悬液浓度为1×106cells/ml，所述多系分化细胞的细胞悬液于造模后1h内进行注射，且注射量为200μl。

技术特征：

1.一种经血源子宫内膜干细胞中muse细胞的分离培养方法，其特征在于，所述muse细胞由经血源子宫内膜干细胞的样本中分离和培养，该muse细胞鉴定后验证了具有cd105和sseea3阳性表达。

2.如权利要求1所述的经血源子宫内膜干细胞中muse细胞的分离培养方法，其特征在于，所述分离培养方法包括以下步骤：

3.如权利要求2所述的经血源子宫内膜干细胞中muse细胞的分离培养方法，其特征在于，所述重悬处理采用胰酶进行8h重悬，每1.5*106细胞使用5ml的胰酶进行重悬。

4.如权利要求2所述的经血源子宫内膜干细胞中muse细胞的分离培养方法，其特征在于，所述富集处理的环境温度为37℃，co2浓度为5%，富集处理的时间为8h。

5.如权利要求1所述的经血源子宫内膜干细胞中muse细胞的分离培养方法，其特征在于，所述悬浮培养介质经过甲基丙烯酸2-羟乙酯处理，且对所述细胞悬液中添加甲基纤维素；

6.一种多系分化应激耐受细胞在脑出血中的应用，其特征在于，所述多系分化应激耐受细胞为权利要求1-5所述的分离培养方法所提取到的muse细胞。

7.如权利要求6所述的多系分化耐受细胞在脑出血中的应用，其特征在于，所述脑出血的模型为大鼠ich模型。

8.如权利要求6所述的多系分化耐受细胞在脑出血中的应用，其特征在于，所述大鼠ich模型的构建方式包括以下步骤：

9.一种多系分化耐受细胞在急性肝损伤中的应用，其特征在于，所述多系分化耐受细胞为权利要求1-5所述的分离培养方法所提取到的muse细胞。

10.如权利要求6-8所述的多系分化耐受细胞在脑出血中的应用，其特征在于，所述多系分化细胞通过静脉移植对脑出血部位进行修复，所述多系分化细胞的细胞悬液浓度为1×106cells/ml，所述多系分化细胞的细胞悬液于造模后1h内进行注射，且注射量为200μl。

技术总结
本发明提供一种经血源子宫内膜干细胞中Muse细胞的分离培养方法及应用，属于细胞工程技术领域，所述Muse细胞由经血源子宫内膜干细胞的样本中分离和培养，该Muse细胞鉴定后验证了具有CD105和SSEEA3阳性表达，本发明从经血中提取出了能够应用于脑出血治疗以及急性肝损伤治疗的Muse细胞，且在脑出血的治疗当中构建了相应的用来观测评估Muse细胞改善脑出血的模型。

技术研发人员：林俊堂,李晗,魏景辉
受保护的技术使用者：新乡医学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16