一种降解生物胺苹果酸-乳酸发酵菌粉的制备方法及其应用

本发明属于食品微生物发酵，涉及一种降解生物胺苹果酸-乳酸发酵菌粉的制备方法及其在葡萄酒酿造中的应用。

背景技术：

1、苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation,mlf)是红葡萄酒酿造过程中由乳酸菌进行的第二个重要步骤，可以通过自带的乳酸菌株进行自发发酵，也可以接种选定的细菌发酵剂(如酒酒球菌和植物乳杆菌)来诱导。然而，在自发发酵过程中，会出现苹果酸转化成乳酸的速度缓慢、转化不完全等问题。因此，使用细菌发酵剂可以最大程度地降低这些风险。生物胺(biogenic amines，ba)是mlf过程中由于乳酸菌的生长代谢产生的一类含氮有机化合物，由微生物的氨基酸脱羧酶对前体化合物进行脱羧作用以及酮和醛的还原胺化而形成。葡萄酒中的生物胺如果以高浓度存在，可能对消费者的健康产生毒性作用(如过敏反应、恶心、震颤等)，同时也被视为葡萄酒质量安全的重要指标。

2、课题组前期筛选出一株可用于mlf且能降解生物胺的植物乳杆菌nxu-q12(专利申请号为202210163895.5)，如果将其制备成活性菌粉，不仅便于储藏和运输，而且将其应用于葡萄酒酿造中有着广阔的前景。

技术实现思路

1、本发明实施例的目的在于提供一种降解生物胺苹果酸-乳酸发酵菌粉的制备方法，旨在为葡萄酒酿造提供一种具有降低生物胺能力的苹果酸-乳酸发酵剂。具体技术方案如下：

2、一种降解生物胺苹果酸-乳酸发酵菌粉的制备方法，包括以下步骤：

3、步骤一：将低温(-80℃)保藏的植物乳杆菌nxu-q12(保藏号cgmccno.23704)活化，然后接种于mrs液体培养基，37℃培养24-30h，用稀释涂布法计数，制成种子液。将种子液按2-5％的接种量接入20l不锈钢发酵罐中，增殖培养后离心收集菌体。

4、步骤二：将步骤一中所得菌体与冻干保护剂混合均匀后平衡30min，然后于-18～-20℃预冻12-16h，再进行真空冷冻干燥制得菌粉，于-18～-20℃冰箱保存。

5、具体地，所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)nxu-q12，已在专利cn114395512a“一株可降解生物胺的乳酸菌及其应用”中公开，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.23704，保藏日期为2021年11月1日。

6、进一步的，步骤一中活化后的植物乳杆菌按照2-5％的接种量接入100ml、初始ph为6.2-6.5的mrs液体培养基，37℃培养24-30h，制备种子液。

7、进一步的，步骤一所述20l不锈钢发酵罐的培养条件为：分别进行空消、实消灭菌，灭菌条件为121℃蒸汽灭菌30min，装液系数为0.75，发酵前ph电极标定范围6.0-6.5，于37℃培养48h。

8、进一步的，步骤一所述离心收集菌体的条件为4000-5000r/min，10-20min。

9、进一步的，步骤二所述的冻干保护剂由糖类(菊粉、半乳糖、海藻糖，用量6-12％)、蛋白质类(脱脂乳粉、乳清蛋白，用量5-10％)、氨基酸类(l-谷氨酸钠、半胱氨酸、组氨酸，用量6-12％)、多羟基类(丙三醇、甘露醇、山梨醇，用量6-12％)组成。

10、进一步的，步骤二所述菌体与复合保护剂的混合比例为1:1-1:2.5，二者平衡时间为30min。

11、进一步的，步骤二所述真空冷冻干燥条件为：scientz-10z型真空冷冻干燥机，真空度0.37mbar，冷阱温度-55℃，隔板温度-25℃，冷冻时间24h。

12、进一步的，如步骤二制得的乳酸菌粉最佳贮藏温度为-20℃，储藏3个月后活菌数为3.87×107cfu/g，储藏8个月后活菌数为0.63×107cfu/g。

13、本发明另一个目的还提供该植物乳杆菌粉在葡萄酒酿造中的应用。

14、进一步的，将制备的乳酸菌粉以原保护介质或生理盐水复溶，复溶时间为30min，然后按1g/100l的接种量接入酒精发酵结束的葡萄醪液中进行苹果酸-乳酸发酵。

15、本发明的有益技术效果是：

16、1、本发明将前期筛选的降解生物胺的植物乳杆菌制成冻干粉，使用以糖类、蛋白质类、氨基酸类和多羟基类物质组成的复合冻干保护剂，有利于提高菌体的冻干存活率。如最优的冻干菌粉保护剂配方为：菊粉6％、脱脂乳粉5％、甘露醇9％、l-谷氨酸钠9％，将该复合保护剂用于植物乳杆菌冻干粉的制备，菌体存活率达90.89％。将该菌粉贮藏在-20℃冰箱中，3个月后活菌数为3.87×107cfu/g，8个月后活菌数为0.63×107cfu/g。

17、2、将本发明方法制备的植物乳杆菌粉采用原保护介质或生理盐水复溶，在复水时间为30min时，在生理盐水中存活率为84.63％，在原保护介质中存活率为89.14％，比常规采用无菌水复溶的菌株存活率高；而将该菌粉用于赤霞珠葡萄酒苹果酸-乳酸发酵中，不仅具有良好的苹乳发酵能力，还能降低葡萄酒中生物胺含量，提高葡萄酒的安全性。

技术特征：

1.一种降解生物胺苹果酸-乳酸发酵菌粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中活化后的植物乳杆菌按照2-5％的接种量接于100ml、初始ph为6.2-6.5的mrs液体培养基，37℃培养24-30h，制备种子液。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一所述20l不锈钢发酵罐的培养条件为：经过空消、实消灭菌，121℃蒸汽灭菌30min，装液系数为0.75，发酵前ph电极标定范围6.0-6.5，于37℃培养48h。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一所述离心收集菌体的条件为4000-5000r/min，10-20min。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二所述的冻干保护剂由糖类(菊粉、半乳糖、海藻糖，用量6-12％)、蛋白质类(脱脂乳粉、乳清蛋白，用量5-10％)、氨基酸类(l-谷氨酸钠、半胱氨酸、组氨酸，用量6-12％)、多羟基类(丙三醇、甘露醇、山梨醇，用量6-12％)组成。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二所述菌泥与冻干保护剂的混合比例为1:1-1:2.5，平衡时间30min。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中真空冷冻干燥条件为：scientz-10z型真空冷冻干燥机，真空度0.37mbar，冷阱温度-55℃，隔板温度-25℃，冷冻时间24h。

8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二制得的菌粉在-20℃下储藏3个月后活菌数为2.87×107cfu/g，储藏8个月后活菌数为0.63×107cfu/g。

9.如权利要求1所述的制备方法制得植物乳杆菌直投式菌粉。

10.如权利要求8所述的菌粉在葡萄酒酿造中的应用。

11.如权利要求9所述的菌粉在葡萄酒酿造中的应用，其特征在于，复水溶剂为原保护介质或生理盐水，复溶时间为30min，然后接种于酒精发酵结束的葡萄醪液中，用于葡萄酒苹果酸-乳酸发酵过程，不仅具有良好的苹乳发酵能力，还能降低葡萄酒中生物胺含量。

技术总结
本发明公开了一种降解生物胺苹果酸‑乳酸发酵菌粉的制备方法，属于食品微生物发酵技术领域。该方法针对一株具有生物胺降解能力的、可用于葡萄酒苹乳发酵的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)NXU‑Q12进行菌粉制备。首先对该菌株进行高密度培养，收集菌体后，与冻干保护剂混合平衡，冻干保护剂由菊粉、脱脂乳粉、L‑谷氨酸钠和甘露醇制备而成；将菌体和冻干保护剂的混合溶液平铺在冻干器皿中进行预冻处理后，进行真空冷冻干燥，获得的菌粉中菌体存活率达90.89％。将本发明制备方法获得的乳酸菌粉用于赤霞珠葡萄酒的酿造过程，与原菌液相比，苹乳发酵结束后腐胺、精胺、尸胺和色胺的降解率差异不显著(P＜0.05)，说明该制备方法可以最大程度地保留菌株活性。

技术研发人员：田晓菊,喜琴琴,潘思弋,张惠玲,袁园,杨伟明
受保护的技术使用者：宁夏大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15