一种芹菜原生质体及其制备方法和应用

本发明涉及原生质体制备领域，特别是涉及一种芹菜原生质体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、原生质体是具有全能性和活力的裸露植物细胞，细胞中各种代谢活动均可在此进行。原生质体提供了一个独特的单细胞系统，是进行基础研究和作物改良的理想材料之一，可用于植物细胞生理学和遗传学等的研究，如细胞壁形成、植株再生、体细胞杂交和瞬时基因表达等。植物原生质体可以从叶片、子叶、花瓣、根、下胚轴、悬浮培养的细胞和愈伤组织等提取制备，分离方法主要有机械法、化学法和酶解法等。研究表明，酶解法获得的原生质体产量高、完整度较好，应用最为广泛。但酶解法分离原生质体受到多种因素的影响，如外植体类型、酶的种类、酶解液的浓度以及酶解时间等。在原生质体的制备过程中，最佳的体系会因不同的植物组织材料而有所差异。例如，在制备烟草(nicotiana tabacum l.)叶片原生质体时，仅需进行4h的酶解时间。然而，对于红麻(hibiscus cannabinus)下胚原生质体的制备，若酶解时间仅为9h，产量会相对较低；而当酶解时间延长至12小时时，原生质体的产量才能达到最高。此外，在制备玉米叶片原生质体时，采用1.5％纤维素酶和0.5％离析酶，在酶解时间为5小时时可获得最佳效果，而对于拟南芥叶片的酶解过程，选择1.5％纤维素酶和0.4％离析酶的酶液组合效果极佳。

2、原生质体由于细胞壁已被酶促或机械去除，在一定处理下，很容易接受外源性细胞器和核酸。瞬时基因表达提供了一种快速有效的技术，用于细胞、分子、生化和遗传学研究，特别是用于快速评估基因功能，如亚细胞蛋白定位，蛋白质和蛋白质相互作用，蛋白质活性和信号转导等。peg介导法是研究最透彻、应用最广泛的一种原生质体转化方法，且peg介导法转化原生质体，操作便捷、用时短、实验成本低、重复性好、转化效率较高，可直接作用于单个细胞，从而更直接地研究外源物质在细胞内的瞬时表达，因此广泛应用于植物分子生物学等。目前，原生质体分离和基于原生质体的瞬时基因表达的协议已经建立在多种植物物种，如拟南芥、黄瓜、玉米、甜樱桃以及木薯，加速了这些植物中基因的高通量分析和快速功能表征。

3、芹菜(apium graveolens l.)为伞形科芹属二年生蔬菜，原产自地中海地区，近年来，人们生活水平和健康意识逐步提高，芹菜的潜在功效也被不断开发和利用，而作为一种健康的蔬菜作物，芹菜在消费市场中备受青睐。目前，芹菜全基因组已被全部测序完成，然而其基因的亚细胞定位主要采用以烟草为载体进行，尽管异源表达系统可以用于基因功能研究，但是由于遗传背景是外来的，可能会显示异常结果。例如，一些引入烟草的拟南芥基因的编码蛋白已被证明是错误定位。因此，有必要开发一个有效的基于原生质体的芹菜瞬时基因表达系统。目前，尚未有比较完备的芹菜原生质体制备与转化方法，现有的芹菜原生质体制备技术耗时长，制备困难，所得的原生质体无法满足后续的遗传转化等基因功能研究。因此，建立高效的芹菜原生质体制备及转化体系对于研究芹菜基因功能和基因编辑至关重要。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种芹菜原生质体及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。本发明探索优化了芹菜叶片原生质体的分离和纯化，成功制备出大量高活力的芹菜原生质体，并提供了一种用于peg介导的芹菜叶片原生质体转化的高效瞬时表达系统，最后，将该系统应用于agmyb80的亚细胞定位研究，为芹菜基因功能的研究和基因编辑提供了强力支撑。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种芹菜原生质体的制备方法，以芹菜幼嫩叶片为材料，在含有纤维素酶、果胶酶和甘露醇的酶解液中酶解后，经过离心获得芹菜原生质体。

4、进一步地，所述酶解液的成分包括2.0wt％纤维素酶、0.10wt％果胶酶、0.6m甘露醇、20mm kcl、10mm cacl2、20mm mes、5mm巯基乙醇和0.1wt％bsa。

5、进一步地，所述酶解的条件为25℃，黑暗条件下孵育8h。

6、进一步地，所述离心的速度为200×g。

7、进一步地，在所述离心后还包括将所述芹菜原生质体用w5盐溶液重悬。

8、进一步地，所述w5盐溶液的成分包括2mm mes、154mm nacl、125mm cacl2和5mmkcl，ph 5.7。

9、本发明还提供一种上述制备方法获得的芹菜原生质体。

10、本发明还提供一种所述的芹菜原生质体在构建芹菜遗传转化瞬时表达系统中的应用。

11、本发明还提供一种芹菜基因的瞬时表达方法，包括利用所述的芹菜原生质体瞬时表达芹菜基因的步骤。

12、本发明还提供一种所述的芹菜原生质体在对芹菜基因亚细胞定位中的应用。

13、本发明还提供一种芹菜基因的亚细胞定位研究方法，包括将带有荧光标记的芹菜基因转化所述的芹菜原生质体，通过荧光标记对所述芹菜基因进行亚细胞定位的步骤。

14、本发明公开了以下技术效果：

15、本发明优化了芹菜原生质体的制备方法，用2.0％纤维素酶和0.1％果胶酶在含有0.6m甘露醇的酶解液中酶解8h，选择200×g的离心速度，成功制备出大量高活力的芹菜原生质体，其产量达到了8.22×107个，活力达到95％。

16、本发明首次建立了高效、稳定的芹菜原生质体瞬时转化体系。多次重复试验表明，原生质体浓度为升5×107个·ml-1，质粒浓度为50μl·ml-1，用40％浓度的peg4000孵育10min，原生质体转化率可达53％左右。并利用芹菜原生质体转化体系进行了芹菜agmyb80基因的亚细胞定位，结果发现agmyb80定位在细胞核中。

17、本发明建立了一套高效、稳定、快速的芹菜原生质体制备及瞬时表达系统，可用于蛋白质亚细胞定位和蛋白互作分析，为芹菜基因功能的研究和基因编辑提供了强力支撑。

技术特征：

1.一种芹菜原生质体的制备方法，其特征在于，以芹菜幼嫩叶片为材料，在含有纤维素酶、果胶酶和甘露醇的酶解液中酶解后，经过离心获得芹菜原生质体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解液的成分包括2.0wt％纤维素酶、0.10wt％果胶酶、0.6m甘露醇、20mmkcl、10mmcacl2、20mmmes、5mm巯基乙醇和0.1wt％bsa。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的条件为25℃，黑暗条件下孵育8h。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述离心的速度为200×g。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述离心后还包括将所述芹菜原生质体用w5盐溶液重悬；所述w5盐溶液的成分包括2mmmes、154mmnacl、125mmcacl2和5mmkcl，ph5.7。

6.一种如权利要求1-5任一项所述的制备方法获得的芹菜原生质体。

7.一种如权利要求6所述的芹菜原生质体在构建芹菜基因瞬时表达系统中的应用。

8.一种芹菜基因的瞬时表达方法，其特征在于，包括利用权利要求6所述的芹菜原生质体瞬时表达芹菜基因的步骤。

9.一种如权利要求6所述的芹菜原生质体在芹菜基因亚细胞定位中的应用。

10.一种芹菜基因的亚细胞定位研究方法，其特征在于，包括将带有荧光标记的芹菜基因转化权利要求6所述的芹菜原生质体，通过荧光标记对所述芹菜基因进行亚细胞定位的步骤。

技术总结
本发明公开了一种芹菜原生质体及其制备方法和应用，属于原生质体制备领域。所述芹菜原生质体以芹菜幼嫩叶片为材料，在含有纤维素酶、果胶酶和甘露醇的酶解液中酶解后，经过离心获得。本发明优化了芹菜原生质体的制备方法，用2.0％纤维素酶和0.1％果胶酶在含有0.6M甘露醇的酶解液中酶解8h，选择200×g的离心速度，成功制备出大量高活力的芹菜原生质体，并以此建立了高效、稳定的芹菜原生质体瞬时转化体系，成功实现了芹菜基因的亚细胞定位，为芹菜基因功能的研究和基因编辑提供了强力支撑。

技术研发人员：李梦瑶,杜佳庚,李晓燕,李威龙,张辉涛,汤浩茹,王小蓉,罗娅,张勇,陈清,王燕,林源秀,张云婷,何文,刘泽静
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16