一种腈水合酶工程菌发酵工艺的制作方法

本发明涉及生物，特别涉及一种腈水合酶工程菌发酵工艺。

背景技术：

1、腈水合酶(nitrile hydratase，简称nhase，ec 4.2.1.84)是一种能够催化腈类物质生成腈水合酶(nitrile hydratase，简称nhase，ec 4.2.1.84)是一种能够催化腈类物质生成酰胺类化合物的金属酶，主要用于工业上丙烯酰胺和烟酰胺的生产。常见nhase大多数来源于红球菌属(rhodococcus)、假诺卡氏菌属(pseudonocardia)以及诺卡氏菌(nocardia)。根据nhase活性中心所含金属离子的不同，一般可将其分为铁型腈水合酶(fe-nhase)和钴型腈水合酶(co-nhase)，活性中心分别含有一个非血红素铁离子和一个非咕啉态钴离子，并且金属离子都位于α亚基保守序列-cys-x-leu-cys(so2h)-ser-cys(soh)上，其中包含两个被氧化的半胱氨酸残基：被深度氧化的硫酰基(—so2—)和被浅度氧化的亚硫酰基(—so—)。生物体内，nhase通常与腈水解酶、酰胺酶这两种关键酶一起发挥作用进行腈类物质代谢。

2、目前很多化工产品的生产已经由传统的化学方法转变为以酶或全细胞为主的生物法，nhase就是其中最有代表性的例子，其用于酰胺类物质如丙烯酰胺、尼克酰胺以及5-氰基戊酰胺的生产已有数十年历史。尼可酰胺是一种水溶性维生素，也是一种用于药物和杀虫剂合成的重要中间体，在制药行业和食品工业中有重要应用。目前用于生产尼可酰胺的菌株为玫瑰色红球菌rhodococcusrhodochrousj1(j1)，它也是第三代工业菌株。在j1中同时存在两种不同类型的腈水合酶，按其分子量不同分为高分子量腈水合酶(h-nhase)和低分子量腈水合酶(l-nhase)。虽然目前工业生产烟酰胺主要用j1这一生产菌，但其培养时间长，蛋白表达量低。相比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优势：菌体生长速度快，蛋白表达量高。目前，l-nhase和h-nhase已在大肠杆菌表达系统中实现高效表达，这就使得用蛋白表达量高的重组基因工程菌替代现有的工业用菌成为可能。

3、大肠杆菌高密度发酵技术是一种通过一定的培养方法提高菌体生物量从而提高蛋白表达量的有效手段。目前很多表达酶蛋白或抗生素等异源物质的重组大肠杆菌都实现了高密度扩大培养。若想真正在工业规模用大肠杆菌替代红球菌生产烟酰胺，高密度发酵技术的实现就非常有必要。

4、目前的发酵技术具有如下缺陷：

5、发酵周期长，通常在100小时左右，酶活普遍在4000-7000u/ml左右，发酵不稳定存在溶菌的情况。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种腈水合酶工程菌发酵工艺，可以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、参阅图1，一种腈水合酶工程菌发酵工艺，包括如下步骤：

4、步骤1：一级种子液的制备：将各菌种自平板上培养后挑单克隆接种至一级种子液250ml摇瓶中，卡那霉素浓度为50μg/ml，33-37℃摇床培养8-12h，摇床转速220rpm，得一级种子液；

5、步骤2：二级种子液的制备：将培养好的一级种子液按1.0％-7.5％接种量接入二级种子液250ml摇瓶中，卡那霉素浓度为50μg/ml，33-37℃摇床培养8-12h，摇床转速220rpm，得二级种子液；

6、步骤3：发酵培养：在二级种子液里加入卡纳霉素，卡那霉素浓度为50μg/ml，以1.0％-7.5％％接种量将二级种子液接入发酵罐内，温度37℃条件下，发酵周期60-110h，培养过程中，空气流量2～4l/min，溶氧35％～50％，ph值控制6.5-7.5，发酵前期溶氧持续降低，待溶氧回升时采取补料分批发酵方式，od 600达到55-65时，降温至22-28℃补加诱加乳糖诱导产酶，待发酵后期od增长慢或者降低时停止发酵。

7、进一步地，步骤1中的菌种采用一株大肠杆菌m910001，保藏编号为cgmccno.20430。

8、所述步骤1一级种子液培养基组成为：酵母粉2-8g/l，蛋白胨8-12g/l，氯化钠8-12g/l。

9、进一步地，所述步骤2二级种子液培养基组成为：酵母粉20-28g/l，蛋白胨10-14g/l，甘油8-12g/l，磷酸二氢钾1.2-3.4g/l，磷酸氢二钾10-22g/l。

10、进一步地，所述步骤3发酵培养基组成为：酵母粉20-44g/l，蛋白胨16-24g/l，甘油8-12g/l，磷酸二氢钾1-5g/l，十二水磷酸氢二钠12-22g/l，氯化钠0.5-1.5g/l，氯化铵0.5-1.5g/l，七水硫酸镁0.5-2g/l，其余为水。

11、进一步地，所述补料培养基组成为：酵母粉80-120g/l、甘油360-440g/l。

12、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

13、本发明对细胞培养基首先进行了摇瓶水平优化，使菌体生物量和细胞酶活得到提高；建立烟酰胺生产的催化工艺，使得表达h-nhase腈水合酶基因大肠杆菌催化烟腈生成终浓度更高的烟酰胺产物；对重组菌进行了分批补料扩大培养，实现了大肠杆菌高密度培养和重组蛋白的大量表达；最后与实际生产情况相结合，用高密度的发酵罐培养后重组菌进行烟腈催化反应，产物浓度相比摇瓶发酵细胞的催化有进一步的提高，优化后的工艺方法有效的缩短整个发酵周期，同时提高了腈水合酶的od及酶活。

技术特征：

1.一种腈水合酶工程菌发酵工艺，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的腈水合酶工程菌发酵工艺，其特征在于，步骤1中的菌种采用一株大肠杆菌m910001，保藏编号为cgmcc no.20430。

3.如权利要求1所述的腈水合酶工程菌发酵工艺，其特征在于，所述步骤1一级种子液培养基组成为：酵母粉2-8g/l，蛋白胨8-12g/l，氯化钠8-12g/l。

4.如权利要求3所述的腈水合酶工程菌发酵工艺，其特征在于，一级种子液培养基组成为：酵母粉5g/l,蛋白胨10g/l,氯化钠10g/l。

5.如权利要求1所述的腈水合酶工程菌发酵工艺，其特征在于，所述步骤2二级种子液培养基组成为：酵母粉20-28g/l，蛋白胨10-14g/l，甘油8-12g/l，磷酸二氢钾1.2-3.4g/l，磷酸氢二钾10-22g/l。

6.如权利要求5所述的腈水合酶工程菌发酵工艺，其特征在于，二级种子液培养基组成为：酵母粉24g/l,蛋白胨12g/l,甘油10g/l，磷酸二氢钾2.31g/l,磷酸氢二钾16.43g/l。

7.如权利要求1所述的腈水合酶工程菌发酵工艺，其特征在于，所述步骤3发酵培养基组成为：酵母粉20-44g/l，蛋白胨16-24g/l，甘油8-12g/l，磷酸二氢钾1-5g/l，十二水磷酸氢二钠12-22g/l，氯化钠0.5-1.5g/l，氯化铵0.5-1.5g/l，七水硫酸镁0.5-2g/l，其余为水。

8.如权利要求7所述的腈水合酶工程菌发酵工艺，其特征在于，发酵培养基组成为：酵母粉32g/l,蛋白胨20g/l,甘油10g/l，磷酸二氢钾3g/l,十二水磷酸氢二钠17.1g/l，氯化钠1g/l，氯化铵1g/l，七水硫酸镁1.3g/l，其余为水。

9.如权利要求1所述的腈水合酶工程菌发酵工艺，其特征在于，所述补料培养基组成为：酵母粉80-120g/l、甘油360-440g/l。

技术总结
本发明公开了一种腈水合酶工程菌发酵工艺，包括如下步骤：在二级种子液里加入卡纳霉素，以1.0％‑7.5％％接种量将二级种子液接入发酵罐内，温度37℃条件下，发酵周期60‑110h，培养过程中，空气流量2～4L/min，溶氧35％～50％，发酵前期溶氧持续降低，待溶氧回升时采取补料分批发酵方式，OD 600达到55‑65时，降温至22‑28℃补加诱加乳糖诱导产酶，待发酵后期OD增长慢或者降低时停止发酵，本发明优化后的工艺方法有效的缩短整个发酵周期，同时提高了腈水合酶的OD及酶活。

技术研发人员：史玉龙,陈森林,濮梦华,韩道平,张伟
受保护的技术使用者：江西海文生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8