一种重组人血清白蛋白的纯化方法与流程

本发明涉及蛋白纯化领域，具体涉及一种重组人血清白蛋白的纯化方法。

背景技术：

1、人血清白蛋白，又称人血白蛋白，人血白蛋白是血液或血浆中一种主要蛋白成分，占血液的45％～55％，占血浆的70％～80％。人血清白蛋白由585个氨基酸构成，为分子量约66kd的非糖基化蛋白，由肝脏合成，在人体内半衰期约为18-21天，体内的合成速率约为828mg/kg/day，成年人血液内的人血白蛋白浓度为45g/l左右。人血白蛋白在人体主要作用机制为增加血容量和维持血浆胶体渗透压。正常人体内的血清白蛋白浓度维持在一定范围内，当低于正常水平临界值(30g/l)时，会导致低白蛋白血症，将引起各种疾病，包括肝硬化腹水、严重脓毒症、恶性腹水、透析内低血压等疾病关联的低白蛋白血症等，在临床上，人血清白蛋白被广泛应用于失血创伤、烧伤引起的休克、脑水肿及损伤引起的颅压升高、肝硬化及肾病引起的水肿或腹水、低蛋白血症的防治、新生儿高胆红血症、用于心肺分流术、烧伤的辅助治疗、血液透析的辅助治疗和成人呼吸窘迫综合征的治疗。其用途广泛，且用量巨大。目前广泛使用的人血清白蛋白主要是从人血浆或胎盘血中通过低温乙醇法(cohn法)结合柱层析法进行提取制备的，这种方式原料分散，血浆容易被病原体，如肝炎病毒、艾滋病毒等污染，而且原料供应日益紧张，因此制备价格也在逐年上升。

2、随着人血清白蛋白供需矛盾的加剧和质量控制方面要求的提高，基因重组人血清白蛋白逐渐成为人血清白蛋白制药工业发展的方向和潮流。基因重组人血清白蛋白采用现代生物技术生产，不受人血清白蛋白的上述因素制约，不仅具有同样的适用范围，还具有纯度更高、无动物组分、无病毒残留等优势，其市场前景十分广阔。近些年，国际上许多实验室和公司都尝试通过基因工程手段，运用各种表达体系开发基因重组人血清白蛋白，把人血清白蛋白基因克隆到细菌、真菌、植物及动物中进行表达。采用毕赤酵母进行重组人血清白蛋白的发酵则是目前备受关注的方式。

3、由于人血清白蛋白具有结合小分子的3个结合位点，在血液里可逆性结合小分子的特性。因此在重组人血清白蛋白纯化过程中，重组人血清白蛋白可以非特异性地结合内毒素等小分子，将内毒素含量降低到可以中国药典和美国药典的人血清白蛋白项下的内毒素标准极为困难。

4、除此之外，安全性是药物成药性的关键，重组人血清白蛋白在临床上的安全性更是具有挑战性。首先，由于人血清白蛋白在临床上使用剂量高达10℃50克，较单克隆抗体药物剂量(0.2℃0.5g)高50℃100倍，因而控制较低的残留宿主蛋白(hostcellprotein，hcp)含量具有极大地挑战性。然而高纯度重组人血清白蛋白可以通过增加纯化步骤来去除hcp，达到蛋白药物的纯度要求，但增加纯化步骤不仅降低回收率，同时也增加了成本，而药物成本的增加，加上人血清白蛋白高剂量，使得重组人血清白蛋白不具有可及性。因此，重组人血清白蛋白纯度要提高达到安全性阈值的纯度，同时降低生产成本是重组人血清白蛋白的又一个巨大挑战。

5、本领域对于重组人血清白蛋白的纯度要求非常严格，对纯化重组人血清白蛋白的方法存在持续需求，因此，本领域仍需一种能够降低成本，能够规模化生产的，重组人血清白蛋白回收率高的纯化方法。

技术实现思路

1、为克服上述缺点，本发明的目的在于提供一种重组人血清白蛋白的纯化方法。

2、为了达到以上目的，本发明采用的技术方案是：一种重组人血清白蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

3、步骤(1)澄清：将含有重组人血清白蛋白的毕赤酵母发酵液放入离心机进行离心，离心结束后留上清液，对离心结束后的上清液进行除菌过滤得到澄清液；

4、步骤(2)亲和层析：将步骤(1)所得澄清液进行亲和层析，所述澄清液经过稀释后上样，亲和层析填料采用博格隆的blue bestarose ff，亲和层析填料的配基为活性蓝3ga；

5、步骤(3)凝胶过滤层析和热处理：将步骤(2)亲和层析结束后所得样品进行凝胶过滤层析，凝胶过滤层析的基架为交联的葡萄糖，凝胶过滤层析选用的填料为bestdex g-25m；凝胶过滤层析结束后，对凝胶过滤层析后的样品进行热处理；

6、步骤(4)疏水层析：将步骤(3)热处理结束后所得样品进行疏水层析，疏水层析介质为pheny bestarose ff(hs)，疏水层析介质的配基为苯基、丁基或辛基；

7、步骤(5)阴离子层析：将步骤(4)疏水层析结束后的样品进行阴离子层析，阴离子层析填料为deae bestarose ff，阴离子层析填料的配基为二乙基氨基乙基、仲胺或叔胺。

8、进一步的，步骤(1)中离心条件为：离心力为10000-12000g，离心时间为15-25min。

9、进一步的，步骤(1)中的除菌过滤条件：膜材质为pes，截留分子量为0.22-0.45μm，操作压力为0.55mpa。

10、进一步的，步骤(2)中的，稀释后澄清液电导率范围为5-10ms/cm。

11、进一步的，所述步骤(2)中所选亲和层析柱为blue bestarose ff 4.2ml预装柱，填料载量≤20g/l。

12、进一步的，所述步骤(3)中，凝胶过滤层析结束后，样品电导率范围为2-5ms/cm。

13、进一步的，所述步骤(3)热处理时加入稳定剂，热处理条件为：在稳定剂的存在下，水浴锅加热：55-65℃，加热60-90min。。

14、进一步的，所述步骤(3)中的稳定剂为棕榈酸和/或辛酸钠。

15、进一步的，所述步骤(3)中的稳定剂的加入方法为：将稳定剂加入到样品中，使得样品中稳定剂的浓度为8-12mm，ph为6.5-7.5，电导率范围为10-15ms/cm。

16、进一步的，所述步骤(5)中的上样电导率范围为10-15ms/cm。

17、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

18、1.本发明方法仅使用了四步层析，简化了工艺步骤，且四步层析所选用的填料均为国产厂家博格隆的填料，大大降低了工艺生产成本，同时保证了重组人血清白蛋白的纯化效果。

19、2.本发明方法不需要浓缩换液，得到的重组人血白蛋白sec纯度在90％以上，色素杂质的最终含量≤0.04，除杂效果显著。

20、3.本发明方法采用在阴离子层析步骤中采用阴离子流穿工艺，阴离子层析填料为deae bestarose ff，该填料带正电荷，能够吸附带负电荷的杂质，带有正电荷的重组人血清白蛋白进行流穿，不会挂在柱子上，进一步去除杂蛋白、核酸、内毒素等杂质。

21、4.本发明方法的纯化工艺衔接性好，且成本低，易于规模化生产，大大降低了研发和生产成本。

技术特征：

1.一种重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中离心条件为：离心力为10000-12000g，离心时间为15-25min。

3.根据权利要求1或2所述的一种重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中的除菌过滤条件：膜材质为pes，截留分子量为0.22-0.45μm，操作压力为0.55mpa。

4.根据权利要求1所述的一种重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中的，稀释后澄清液电导率范围为5-10ms/cm。

5.根据权利要求1所述的一种重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中所选亲和层析柱为blue bestarose ff 4.2ml预装柱，填料载量≤20g/l。

6.根据权利要求1所述的一种重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于所述步骤(3)中，凝胶过滤层析结束后，样品电导率范围为2-5ms/cm。

7.根据权利要求1所述的一种重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)热处理时加入稳定剂，热处理条件为：在稳定剂的存在下，水浴锅加热：55-65℃，加热60-90min。

8.根据权利要求7所述的一种重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)中的稳定剂为棕榈酸和/或辛酸钠。

9.根据权利要求7或8所述的一种重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)中的稳定剂的加入方法为：将稳定剂加入到样品中，使得样品中稳定剂的浓度为8-12mm，ph为6.5-7.5，电导率范围为10-15ms/cm。

10.根据权利要求1所述的一种重组人血清白蛋白的纯化方法，其特征在于，所述步骤(5)中的上样电导率范围为10-15ms/cm。

技术总结
本发明公开了一种重组人血清白蛋白的纯化方法，具体包括以下步骤：将含有重组人血清白蛋白的毕赤酵母发酵液经过澄清、亲和层析、凝胶过滤层析、热处理、疏水层析和阴离子层析得到重组人血清白蛋白纯品。本发明方法仅使用了四步层析，简化了工艺步骤，且四步层析所选用的填料均为国产厂家博格隆的填料，大大降低了工艺生产成本，同时保证了重组人血白蛋白的纯化效果，得到的重组人血白蛋白SEC纯度在90％以上，色素杂质的最终含量≤0.04，除杂效果显著。

技术研发人员：王德朋,王海洋,曹文金,杨学辉,赵晓剑
受保护的技术使用者：苏州百因诺生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15