一种与合方鲫体重相关的SNP分子标记及其扩增引物和应用

本发明属于分子标记，具体涉及一种与合方鲫体重相关的snp分子标记及其扩增引物和应用。

背景技术：

1、合方鲫(hefang crucian carp)是湖南师范大学省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室研究人员自主培育的新品种，具有肉质鲜美，营养丰富等特点，在实际生产中具有巨大的发展前景，能够创造巨大的经济价值。合方鲫在养殖中的产量与最后的经济效益密切相关，因而高效快速筛选出具有高生长潜力的合方鲫有利于节省养殖时间，降低成本，提高利润。

2、在育种工作中，体重筛选主要是依赖于分子标记。传统的分子标记方法主要包括rflp(限制性内切酶片段长度多态性)标记和aflp(扩增片段长度多态性)标记技术。rflp标记技术的原理是检测dna在限制性内切酶酶切后形成的特定dna片段大小，若dna序列中存在导致酶切位点变化的点或序列突变，则可以通过该方法检测出来。但rflp标记技术在实验过程中要制备探针，需要用到放射性同位素标记和核酸杂交技术，存在安全隐患并且不自动化。aflp标记技术的原理是通过检测限制性内切酶酶切后不同长度的dna片段。但aflp标记技术的试剂盒价格昂贵，并且实验过程中涉及到同位素标记，对样品dna质量要求严格。

3、单核苷酸多态性(snp)是最新一代的遗传分子标记，易于检测和统计，广泛应用于生物学的各个领域。目前，snp已应用于小麦、水稻等作物品种鉴定，石斑鱼、大黄鱼等鱼类抗病品系的筛选，牛、猪等牲畜的生长和发育性状筛选等。启动子是基因表达调控中重要的顺式调控元件，对于转录水平的高低起不可或缺的作用。启动子序列的snp变化将对其调控转录的能力产生影响。研究表明，威宁黄牛cis基因启动子区snp多态性对胸宽等性状产生显著影响。可见，代谢和发育相关基因的启动子区域的snp与某些经济相关性状之间存在关联。

4、脂质代谢是生物体内复杂而重要的生化反应过程，与能量代谢和生长发育密切相关。二酰甘油酰基转移酶2(dgat2)是合成三酰甘油的限速步骤，催化二酰甘油酰基化转化成三酰甘油。该酶在脂肪吸收、合成、储存，血浆中三酰甘油的浓度调节等中发挥作用，与生长发育存在关联。在以往研究中发现，dgat2的遗传多态性影响猪背膘中的脂肪沉积，绒山羊的生长情况和胴体性状，牛的产奶量和乳脂率等。这说明dgat2基因的研究对养殖业中高效筛选优质品系，提高经济产量，增加效益具有重要性。

5、因此，本发明通过研究dgat2基因的启动子区域snp位点与合方鲫生长性状之间的关联，可以在基因水平上筛选具有高生长潜力的合方鲫，为合方鲫生产实践提供技术指导。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种与合方鲫体重相关的snp分子标记及其扩增引物和应用，该方法通过snp分子标记可高效筛选合方鲫体重，由此可选育出具有高生长潜力的合方鲫。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、一种与合方鲫体重相关的snp分子标记，所述分子标记位于dgat2基因中，所述分子标记的序列如seq id no:1所示，该序列的第460位核苷酸为snp位点。

4、本发明提供一种扩增如上所述的与合方鲫体重相关的snp分子标记的引物对，所述引物对的序列分别为：

5、dgat2-f：5’-tttcaacagcaccttatctgcacca-3’；

6、dgat2-r：5’-gaagactttagccccgccctca-3’。

7、本发明提供一种用于检测如上所述的与合方鲫体重相关的snp分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物对。

8、本发明提供一种检测如上所述的与合方鲫体重相关的snp分子标记的方法，所述方法包括以合方鲫的基因组dna为模板，利用以上所述的引物对对其进行pcr扩增以获得pcr产物，对所得的pcr产物进行测序，根据测序峰图，判断基因型。

9、所述方法具体包括以下步骤：(1)提取待测合方鲫基因组dna；(2)通过pcr扩增得到dgat2启动子待测片段，并通过琼脂糖凝胶电泳、胶回收获得纯化的待测扩增样品；(3)进行测序，直接获得待测样品的核苷酸序列；(4)snp分析，通过扩增序列的第460位点上的单核苷酸多态性类型进行体重筛选。

10、进一步地，所述pcr扩增的反应体系为：taq预混料10μl、10μm正向和反向引物各1μl、115ng/μl dna模板1μl和ddh2o 7μl，最终体积为20μl。

11、进一步地，所述pcr扩增的反应条件为：94℃预变性5min，之后进入35个循环，包括：94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸2min，最后再72℃延伸10min。

12、进一步地，所述峰图中若出现单峰，则为纯合基因型；若出现双峰，则是杂合基因型。

13、进一步地，所述纯合基因型为aa型、gg型，杂合基因型为ga型。

14、进一步地，所述基因型为ga型的合方鲫个体的体重高于aa型，基因型为gg型的合方鲫个体的体重与ga型、aa型的无显著差异性。

15、本发明的snp分子标记、引物对或试剂盒主要应用于选育具有高生长潜力的合方鲫。

16、与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：

17、1、本发明通过pcr扩增、sanger法测序分析出dgat2启动子的snp，并根据不同snp类型与性状的关联进行育种过程中的体重筛选，可以在基因水平上筛选具有高生长潜力的合方鲫，为合方鲫的生产实践提供技术指导，对于选育具有高生长潜力的合方鲫具有重要意义。

18、2、本发明以snp作为分子标记进行合方鲫体重筛选，具有操作简单、成本低廉、遗传稳定性高、检测和统计方便、易实现自动化等优点。本发明设计的引物具有高特异性和高灵敏性，能够实现快速且准确地完成样本扩增，由此可高效快速筛选出具有高生长潜力的合方鲫。

技术特征：

1.一种与合方鲫体重相关的snp分子标记，其特征在于，所述分子标记位于dgat2基因中，所述分子标记的序列如seq id no:1所示，该序列的第460位核苷酸为snp位点。

2.一种扩增如权利要求1所述的与合方鲫体重相关的snp分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的序列分别为：

3.一种用于检测如权利要求1所述的与合方鲫体重相关的snp分子标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物对。

4.一种检测如权利要求1所述的与合方鲫体重相关的snp分子标记的方法，其特征在于，所述方法包括以合方鲫的基因组dna为模板，利用权利要求2所述的引物对对其进行pcr扩增以获得pcr产物，对所得的pcr产物进行测序，根据测序峰图，判断基因型。

5.根据权利要求4所述的检测与合方鲫体重相关的snp分子标记的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系为：taq预混料10μl、10μm正向和反向引物各1μl、115ng/μldna模板1μl和ddh2o 7μl，最终体积为20μl。

6.根据权利要求4所述的检测与合方鲫体重相关的snp分子标记的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应条件为：94℃预变性5min，之后进入35个循环，包括：94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸2min，最后再72℃延伸10min。

7.根据权利要求4所述的检测与合方鲫体重相关的snp分子标记的方法，其特征在于，所述峰图中若出现单峰，则为纯合基因型；若出现双峰，则是杂合基因型。

8.根据权利要求7所述的检测与合方鲫体重相关的snp分子标记的方法，其特征在于，所述纯合基因型为aa型、gg型，杂合基因型为ga型。

9.根据权利要求8所述的检测与合方鲫体重相关的snp分子标记的方法，其特征在于，所述基因型为ga型的合方鲫个体的体重高于aa型，基因型为gg型的合方鲫个体的体重与ga型、aa型的无显著差异性。

10.一种如权利要求1所述的snp分子标记、权利要求2所述的引物对或权利要求3所述的试剂盒在选育具有高生长潜力的合方鲫中的应用。

技术总结
本发明公开一种与合方鲫体重相关的SNP分子标记及其扩增引物和应用，属于分子标记技术领域。所述分子标记位于DGAT2基因中，所述分子标记的序列如SEQ ID NO:1所示，该序列的第460位核苷酸为SNP位点。本发明通过PCR扩增、sanger法测序分析出DGAT2启动子的SNP，并根据不同SNP类型与性状的关联进行育种过程中的体重筛选，可以在基因水平上筛选出具有高生长潜力的合方鲫。本发明方法具有操作简单、成本低廉、遗传稳定性高、检测和统计方便、易实现自动化等优点，可为合方鲫的生产实践提供技术指导，对于选育具有高生长潜力的合方鲫具有重要意义。

技术研发人员：刘少军,周毅,刘慧,钟欢,张纯,陶敏,秦伟玲,戴韬,皮佳敏,周钰玲,张怡
受保护的技术使用者：湖南师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16