一种新型有核红细胞人造血液的培养方法与流程

本发明涉及人造血，具体是一种新型有核红细胞人造血液的培养方法。

背景技术：

1、人类血型系统中包括abo血型和rh等血型有三十多种血型系统。目前，医疗血液需求日益增加，血液供应还是以志愿者捐献为主,常有细菌病毒污染。人类全血是非常复杂的，人造全血几乎是不可能的。人造血的实现方式有两种：第一种是指生物合成具有完全生物学功能的红细胞、白细胞和血小板；另一种是人工合成具有红细胞或血小板主要功能的替代物。人造血因为时程长成本过高还在实验室阶段。研究血液红细胞和血小板形成机制和功能，简化人造血的制备成了当今最紧迫的课题。

2、针对上述问题，我们提供了一种新型有核红细胞人造血液培养方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种新型有核红细胞人造血液的培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种新型有核红细胞人造血液的培养方法，具体包括如下步骤：

4、步骤一：无菌操作下，用10支15ml真空edta-k2抗凝采血管均采孕妇(150天)外周血全血10x10ml，摇匀以避免溶血；

5、步骤二：将步骤一的采血管轻轻装入离心杯，配平后，4℃，2000r/min离心10min，弃上清液，用10ml培养液将每个采血管中的细胞沉淀物分别转入离心管中，充分混匀后，4℃孵育10min，将8ml细胞分离液分别缓缓加入10个离心管底部，将上述血细胞培养液分别转入细胞分离液离心管中，室温1000r/min离心15min，收集红细胞层，用hank's液5ml将每个采血管中的细胞沉淀物分别转入离心管中，离心操作后，洗涤细胞；分别加入5mlpbs液，轻轻混匀，室温下，500r/min离心10分钟，弃上清液，然后用10ml培养液混匀细胞，4℃孵育10min；

6、步骤三：将cd71单抗包被的磁珠100μl分别加入步骤二的细胞离心管中，4℃孵育30min，孵育完成后，加入40ml缓冲液，离心弃上清，加入缓冲液5ml重悬红细胞；

7、步骤四：将分离柱置于磁力架上，先用2ml缓冲液平衡柱子，然后加入细胞悬液，待分离柱中的细胞悬液微量时，再加入2ml缓冲液洗涤分离柱3次；

8、步骤五：取下分离柱，放置到新的15ml离心管中，加入2ml缓冲液，然后将细胞吹下，然后用10ml培养液混匀细胞，4℃孵育10min；

9、步骤六：将步骤5所得细胞经cd71单抗包被的磁珠100μl处理，重复纯化步骤3-5，收集的细胞经四重形态学标准鉴定为有核红细胞，得到种子细胞；

10、步骤七：将种子细胞经悬浮培养体系体外培养扩增得到免脱核的有核人造血红细胞，即完成新型人造血液的制备。

11、作为本发明进一步的方案：所述步骤二的培养液配方包括：500ml 1×pbs、2.5gbsa、0.5mol/l edta(ph值8.0)、5％胎牛血清和0.2％葡萄糖。

12、作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中的分离液包括：9％的聚蔗糖20份、质量分数为33.9％的泛影葡胺11份。

13、作为本发明再进一步的方案：所述步骤三中离心温度为4℃，保持2000r/min离心10min。

14、作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中离心操作包括室温状态下：500r/min离心10分钟。

15、作为本发明再进一步的方案：所制备的新型人造血液的有效成分是有核红细胞。

16、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

17、本发明富集有核红细胞的方法是孕妇血液通过密度梯度离心法和重复免疫磁珠法获得有核红细胞。从细胞增殖情况来看，有核红细胞可以在适当条件下复制扩增，形成更多的有核红细胞，随着培养天数的增加，细胞呈增加趋势，到第5天达高峰，之后趋于平稳；从细胞形态学来看，细胞培养的前几天，细胞保持在有核红细胞的状态。有核红细胞经过适当培养，可以脱核形成无核红细胞，或叫做成熟红细胞，培养至11d时，几乎全部分化为脱核的红细胞，整个培养体系的脱核率达到90％以上，同时生产几乎与去核红细胞等量的血小板。有核红细胞和去核红细胞血红蛋白含量检测表明，红细胞脱核前后，血红蛋白质量和功能没有明显变化，意味着有核红细胞和去核红细胞有同样的输氧功能。同时说明了有核红细胞，去核红细胞和血小板的关系，有核红细胞可以在血液系统复制增生，缓解造血功能，血小板变成了可有可无的成分。尽管红细胞体外扩增和脱核能力以及速度有限，但直接将有核红细胞用于人工输血，保留红细胞核可以保留红细胞在血液系统的复制增生功能，又可以在人造血红细胞培养过程中免除脱核环节，加大造血速度和降低造血成本，解决人造血的困境，成为人造血红细胞方面的重大革新。

技术特征：

1.一种新型有核红细胞人造血液的培养方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种新型有核红细胞人造血液的培养方法，其特征在于，所述步骤二的培养液配方包括：500ml1×pbs、2.5gbsa、0.5mol/ledta(ph值8.0)、5％胎牛血清和0.2％葡萄糖。

3.根据权利要求2所述的新型有核红细胞人造血液的培养方法，其特征在于，所述步骤二中的分离液包括：9％的聚蔗糖20份、质量分数为33.9％的泛影葡胺11份。

4.根据权利要求1所述的新型有核红细胞人造血液的培养方法，其特征在于，所述步骤三中离心温度为4℃，保持2000r/min离心10min。

5.根据权利要求4所述的新型有核红细胞人造血液的培养方法，其特征在于，所述步骤二中离心操作包括室温状态下：500r/min离心10分钟。

6.根据权利要求1所述的一种新型有核红细胞人造血液的培养方法，其特征在于，所制备的新型人造血液的有效成分是有核红细胞。

技术总结
本发明公开了一种新型有核红细胞人造血液的培养方法，首先孕妇血液通过密度梯度离心法和重复免疫磁珠法获得有核红细胞，有核红细胞可以在适当条件下复制扩增，形成更多的有核红细胞，之后趋于平稳；从细胞形态学来看，细胞培养的前几天，细胞保持在有核红细胞的状态，随后有核红细胞脱核形成去核红细胞，经血红蛋白含量检测表明，红细胞脱核前后，血红蛋白质量和功能没有明显变化，意味着红细胞脱核前后有同样的输氧功能，直接将有核红细胞用于人工输血，保留红细胞核既可以保留红细胞在血液系统的复制增生功能，又可以在人造血红细胞培养过程中免除脱核冗长环节，加大造血速度和降低造血成本，解决人造血的困境。

技术研发人员：孙薇,黄德睿,黄彦合
受保护的技术使用者：阿思克立普药业有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24