一种用于判断荔枝种胚焦核性状的SNP分子标记及其应用

本发明属于分子生物工程的，具体涉及一种用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记及其应用。

背景技术：

1、果树种胚败育是指受精后的合子胚受自身或其它因素影响而中途停止发育，导致种子退化、发育不良(小核)甚至完全败育(无核)的现象。种胚败育在许多果树中自然存在，如柑桔、葡萄、枇杷、梨、枣、柿等(张文颖等，2018)。而无核、少核、小核等是果树栽培和育种追求的优良目标性状，因其可以大幅度提高果实的可食率，提高果实的适口性，提高加工性能。但种胚败育后导致的少核和无核现象等通常会影响果实发育，如降低坐果率、减小果实大小等，进而影响产量。此外，种胚败育限制了果树杂交育种亲本的选择。

2、荔枝(litchi chinensis sonn.)是无患子科(sapindaceae)荔枝属(litchisonn.)植物。荔枝原产于我国且在我国有世界上最长的栽培历史，故我国是世界荔枝遗传资源多样性中心，国家荔枝种质资源圃(广州)收集和保存种质资源共有652份。荔枝种胚的发育程度和种子大小具有丰富的遗传多样性，根据荔枝资源的种胚发育状况可分为3类(图1)：①正常大核型：胚胎发育正常，成熟种子大而饱满，如‘黑叶’、‘大造’、‘怀枝’、‘野生荔枝10号’等；②稳定焦核型：种子几乎完全败育，胚胎发育受阻，中途停止，成熟种子细小，败育率非常高，即所谓“焦核”，如‘冰荔’、‘糯米糍’、‘仙进奉’、‘观音绿’等。上述两种类型性状稳定，不易受环境影响。③部分败育(焦核)/大核型：在同一植株不同果穗甚至同一果穗不同的果实中种胚发育不同，果实从正常大核果到焦核果甚至无核之间连续分布，如‘桂味’、‘无核荔’、‘禾虾串’等，这类品种性状不稳定，易受环境的影响，不同的花粉、温度及年份，其果实败育的程度和败育的比例差异较大。

3、荔枝是我国著名的岭南佳果，深受鲜食消费和制干产业的青睐。大部分荔枝种质的果实通常拥有一个不可食用的大核，既无端浪费了光合产物，又严重影响可食率。常见的‘黑叶’、‘怀枝’等大核品种的可食率不到65％。但荔枝中也存在种胚败育率高且性状稳定的“焦核”品种，如‘糯米糍’、‘仙进奉’等的果实可食率超过80％，且‘糯米糍’、‘仙进奉’的市场价格常常高出‘黑叶’或‘怀枝’的4到10倍。毫无疑问，焦核荔枝更受果农和消费者的欢迎。因此，解析荔枝果实焦核形成的分子遗传基础，发掘优异变异位点和关键基因，开发相关分子标记，并应用于生产和育种实践中，对提高荔枝生产效益，促进荔枝消费等具有重要的理论和实践意义。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记及其应用。

2、本发明的技术内容如下：

3、本发明提供了一种用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记，所述snp分子标记位于荔枝第3号染色体第17330407bp碱基，该处碱基为g或a；

4、若该处碱基为g，基因型为gg，则判断荔枝种胚性状为大核或焦核率较低且焦核/大核性状不稳定型

5、若该处碱基为a，基因型为ga或aa，则判断荔枝种胚性状为焦核率高且性状稳定焦核型。

6、本发明还提供了一种用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记的引物对，所述引物对的正向引物的核酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示，反向引物的核酸序列如seq id no.3所示；

7、所述正向引物3’端链接有荧光分子fam标记；

8、所述反向引物的5’端链接有荧光分子hex标记。

9、本发明还提供了一种用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记或其引物对的应用，所述snp分子标记或其引物对用于判断或辅助判断荔枝种胚性状；

10、所述种胚性状包括稳定大核型、不稳定大核型/焦核型、稳定焦核型。

11、本发明还提供了一种用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记的应用，所述snp分子标记用于荔枝育种。

12、本发明还提供了一种所述snp分子标记或其引物对用于判断或辅助判断荔枝种胚性状的方法，包括如下步骤：

13、利用高通量的inteliqube基因分型检测平台进行基于ksap技术的snp基因分型检测，根据所得基因型判断荔枝种胚性状，具体包括如下：

14、1)取荔枝样品的dna，质检后进行分型检测；

15、测量荔枝样品的dna浓度和质量，根据测量结果将所有待测样品统一稀释至适宜的上级浓度(5～10ng/μl左右)；

16、并将dna样品分装；

17、2)配制kasp基因分型混合液

18、包括dna样品、2×kasp master mix+assay；

19、3)将kasp基因分型混合液加到已含dna模板的array tape膜上

20、利用intelliqube的snp基因检测平台编制程序，并依次将384array tape、dna样品板kasp基因分型混合液放置进机器，操作机器执行程序，分别自动进行dna样品稀释液和kasp基因分型混合液向384孔的array tape分装、封膜的过程；

21、4)进行pcr循环反应

22、反应程序为94℃预变性15min，1个循环；94℃变性20sec、61～55℃复性/延伸60sec(-0.6℃/循环)，10个循环；94℃变性20sec、55℃复性/延伸60sec，26个循环；

23、pcr反应结束后，利用intelliqube机器进行荧光数据读取和分析；

24、若该处碱基为g，基因型为gg，则判断荔枝种胚性状为大核或焦核率较低且焦核/大核性状不稳定型

25、若该处碱基为a，基因型为ga或aa，则判断荔枝种胚性状为焦核率高且性状稳定焦核型。

26、本发明的有益效果如下：

27、本发明的用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记，所述snp分子标记位于荔枝第3号染色体第17330407bp碱基，该处碱基为g或a；若该处碱基为g，基因型为gg，则判断荔枝种胚性状为大核或焦核率较低且焦核/大核性状不稳定型，若该处碱基为a，基因型为ga或aa，则判断荔枝种胚性状为焦核率高且性状稳定焦核型；所述snp分子标记为通过利用荔枝资源的基因组重测序数据(过滤后snps)，进行连锁不平衡(ld)分析和全基因组关联分析(gwas)，结合田间表型数据，定位到群体中焦核性状显著相关的snp位点，继而利用kasp基因分型方法，开发出一种通用稳定的snp分子标记。所述snp分子标记对不同荔枝资源品种成功进行了基因分型，验证了该分子标记的有效性。利用本发明snp分子标记在苗期即可快速、准确的判断目标荔枝种胚发育类型性状，筛选出焦核率高且性状稳定的目标优异种质。本发明为荔枝分子育种提供了有效的技术支持，提高了育种效率。

技术特征：

1.一种用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记，其特征在于，所述snp分子标记位于荔枝第3号染色体第17330407bp碱基，该位点碱基为g或a，对应的基因型为gg、ga和aa三种基因型；

2.一种用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记的应用，其特征在于，所述snp分子标记用于判断或辅助判断荔枝种胚发育类型性状；

3.一种用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记的应用，所述snp分子标记用于辅助荔枝育种，提高育种效率，缩短育种周期。

4.一种用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的正向引物的核酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示，反向引物的核酸序列如seq idno.3所示。

5.根据权利要求4所述的用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记的引物对，其特征在于，所述正向引物3’端链接有荧光分子fam标记。

6.根据权利要求4所述的用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记的引物对，其特征在于，所述反向引物的5’端链接有荧光分子hex标记。

7.一种用于判断荔枝种胚焦核性状的snp分子标记的引物的应用，其特征在于，所述snp分子标记或其引物用于判断或辅助判断荔枝种胚发育类型性状；

8.一种权利要求7所述snp分子标记或其引物对用于判断或辅助判断荔枝种胚性状类型的方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求8所述snp分子标记或其引物对用于判断或辅助判断荔枝种胚性状的方法，其特征在于，步骤4)所述pcr反应程序为94℃预变性15min，1个循环；94℃变性20sec、61～55℃复性/延伸60sec(-0.6℃/循环)，10个循环；94℃变性20sec、55℃复性/延伸60sec，26个循环。

10.根据权利要求8所述snp分子标记或其引物对用于判断或辅助判断荔枝种胚性状的方法，其特征在于，根据步骤4)检测得spn分型结果中，若为该位点基因型为gg，则判断荔枝种胚性状为大核或焦核率较低且焦核/大核性状不稳定型；

技术总结
本发明属于分子生物工程的技术领域，具体涉及一种用于判断荔枝种胚焦核性状的SNP分子标记及其应用。所述SNP分子标记位于荔枝第3号染色体第17330407bp碱基，该处碱基为G或A，若该处碱基为G，基因型为GG，则判断荔枝种胚性状为大核或焦核率低且焦核性状不稳定的的品种，若该处碱基为A，基因型为GA/AA则判断荔枝种胚性状焦核率高且焦核性状稳定的品种。通过利用荔枝资源的基因组重测序数据(过滤后SNPs)，进行连锁不平衡和全基因组关联分析，结合田间表型数据，定位到群体中焦核性状显著相关的SNP位点，继而利用KASP基因分型方法，开发出一种高效、通用、稳定的SNP分子标记。

技术研发人员：严倩,姜永华,刘海伦,史发超,文英杰,欧良喜,陈洁珍,蔡长河
受保护的技术使用者：广东省农业科学院果树研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15