检测甲基化水平的试剂及其在制备HPV阴性的头颈鳞状细胞癌诊断产品中的应用的制作方法

本发明涉及生物医学，特别是涉及一种检测甲基化水平的试剂及其在制备hpv阴性的头颈鳞状细胞癌诊断产品中的应用。

背景技术：

1、头颈部肿瘤主要起源于口腔、咽部或喉部的黏膜上皮细胞，且90％以上的头颈部肿瘤为鳞状细胞癌，因此将这些部分的肿瘤统称为头颈鳞状细胞癌(head and necksquamous cell carcinoma，hnscc)。

2、口腔癌和喉癌通常与吸烟、酗酒相关，而咽癌部分归因于人类乳头瘤病毒(humanpapilloma virus，hpv)的感染(主要为hpv-16型)。根据感染hpv与否，可将hnscc患者分为两类：hpv阳性(hpv+hnscc)和hpv阴性(hpv-hnscc)；通常，hpv阳性的hnscc患者具有较好的预后。在过去的30年中，hnscc患者的存活率有所提高，主要归因于hpv阳性的hnscc患者的存活率有所提高；而hpv阴性的hnscc患者的存活率并未得到改善，即现有的诊断和治疗手段并没有提高hpv阴性的hnscc患者的存活率。

3、hpv阴性的hnscc是由黏膜上皮细胞经历过度增生到异型增生再发展为侵袭性癌，但是大多数患者在临床上不会出现明显的癌前病变，确诊时往往已经发展为癌症晚期，且出现淋巴结转移，因此hpv阴性的hnscc的预后较差。

4、此外，目前还没有用于筛查头颈部肿瘤的有效方案，其诊断主要依赖于对病变部位进行组织活检，以及利用影像学检测方法对患者进行病理分期。因此，迫切需要对hpv阴性的hnscc患者的筛查和诊断方法进行改进。

技术实现思路

1、基于此，本发明提供了一种简单便捷、高灵敏度、高特异性的检测甲基化水平的试剂在制备hpv阴性头颈鳞状细胞癌的诊断产品中的应用。

2、具体技术方案如下：

3、根据本发明的一个方面，提供了检测目标区域的甲基化水平的试剂，以grch38.p14为参考基因组，所述目标区域包括chr2:118849988～118850355负链的全长或部分区域。

4、在其中一个实施例中，所述目标区域的部分区域包括区域1～2中的一个或多个：

5、区域1为chr2:118849988～118850180负链，以及

6、区域2为chr2:118850154～118850355负链。

7、在其中一个实施例中，所述试剂通过如下方法中的一种或几种实现对目标区域的检测：

8、甲基化特异性pcr、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量pcr法。

9、在其中一个实施例中，所述试剂包括检测所述目标区域的甲基化水平的核酸产品；

10、可选地，所述核酸产品包括引物对和检测探针中的一种或多种。

11、在其中一个实施例中，所述核酸产品包括如下引物对中的一对或多对：

12、检测区域1的甲基化引物对，核苷酸序列如seq id no.7～8所示；

13、检测区域1的非甲基化引物对，核苷酸序列如seq id no.9～10所示；以及

14、检测区域2的甲基化引物对，核苷酸序列如seq id no.11～12所示。

15、在其中一个实施例中，所述核酸产品包括如下引物对和检测探针的组合中的一组或多组：

16、(1)核苷酸序列如seq id no.13～14所示的引物对；检测探针的核苷酸序列如seqid no.15所示；

17、(2)核苷酸序列如seq id no.16～17所示的引物对，检测探针的核苷酸序列如seqid no.18所示；

18、(3)核苷酸序列如seq id no.19～20所示的引物对，检测探针的核苷酸序列如seqid no.21所示；

19、(4)核苷酸序列如seq id no.22～23所示的引物对，检测探针的核苷酸序列如seqid no.24所示；

20、(5)核苷酸序列如seq id no.25～26所示的引物对，检测探针的核苷酸序列如seqid no.27所示；以及

21、(6)核苷酸序列如seq id no.28～29所示的引物对，检测探针的核苷酸序列如seqid no.30所示。

22、在其中一个实施例中，检测的样本包括血液样本、口腔脱落细胞样本或唾液样本。

23、根据本发明的另一方面，提供了一种检测hpv阴性头颈鳞状细胞癌的试剂盒，包含上述任一项所述的试剂。

24、在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、pcr反应试剂、测序试剂、阴性对照品和阳性对照品中的一种或多种；

25、可选地，所述pcr反应试剂包括扩增缓冲液、dntps、dna聚合酶和mg2+中的一种或者多种。

26、根据本发明的另一方面，提供了上述任一项所述的试剂或上述任一项所述的试剂盒在制备hpv阴性的头颈鳞状细胞癌诊断产品中的应用。

27、与传统技术相比，本发明具有如下有益效果：

28、本发明通过检测chr2:118849988～118850355负链dna的全长或部分区域的甲基化水平，能够对不同病理分期和不同类型的hpv阴性头颈鳞状细胞癌患者进行诊断，且检测的灵敏度和特异性高，能够为hpv阴性头颈鳞状细胞癌患者的筛查和诊断提供新思路。

技术特征：

1.检测目标区域的甲基化水平的试剂，其特征在于，以grch38.p14为参考基因组，所述目标区域包括chr2:118849988～118850355负链的全长或部分区域。

2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述目标区域的部分区域包括区域1～2中的一个或多个：

3.根据权利要求1～2任一项所述的试剂，其特征在于，所述试剂通过如下方法中的一种或几种实现对目标区域的检测：

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述试剂包括检测所述目标区域的甲基化水平的核酸产品；

5.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述核酸产品包括如下引物对中的一对或多对：

6.根据权利要求4所述的试剂，其特征在于，所述核酸产品包括如下引物对和检测探针的组合中的一组或多组：

7.根据权利要求1～2、4～6任一项所述的试剂，其特征在于，检测的样本包括血液样本、口腔脱落细胞样本或唾液样本。

8.一种检测hpv阴性头颈鳞状细胞癌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～7任一项所述的试剂。

9.根据权利要求8所述的检测hpv阴性头颈鳞状细胞癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括核酸提取试剂、甲基化转化试剂、pcr反应试剂、测序试剂、阴性对照品和阳性对照品中的一种或多种；

10.权利要求1～7任一项所述的试剂或权利要求8～9任一项所述的试剂盒在制备hpv阴性的头颈鳞状细胞癌诊断产品中的应用。

技术总结
本发明提供了一种检测甲基化水平的试剂及其在制备HPV阴性的头颈鳞状细胞癌诊断产品中的应用；以GRch38.p14为参考基因组，所述目标区域选自Chr2:118849988～118850355负链的全长或部分区域。本发明研究发现，通过检测Chr2:118849988～118850355负链DNA的全长或部分区域的甲基化水平，能够对不同病理分期和不同类型的HPV阴性头颈鳞状细胞癌患者进行诊断，且检测的灵敏度和特异性高，能够为HPV阴性头颈鳞状细胞癌患者的筛查和诊断提供新思路。

技术研发人员：周谛晗,周俊,董兰兰,梁嘉琳
受保护的技术使用者：武汉艾米森生命科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16