一种超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法及应用

本发明涉及一种超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法及应用，属于转基因动物模型构建。

背景技术：

1、随着分子生物学的快速发展，基因修饰动物模型被越来越广泛应用到包括心脏疾病内的各种疾病中。从最初的全身基因敲除或过表达，到器官或组织靶向性的基因敲除或过表达，对于模式动物基因修饰的要求也不断提高，不仅是器官或组织特异性，而且由于疾病的致病机制的不同还需要做到特定部位的基因修饰。以心脏疾病为例，由心房肌和心室肌导致的心肌肥厚或心律失常无论从致病机制、诊断标准还是治疗手段都是明显不同的，而且左心室和右心室由于位置的不同，对于高血压、心肌病等的调控也是有很大差异的。近年来的研究发现，左心和右心、心房和心室存在差异性的基因表达，甚至有些基因仅仅在心脏一个部位特异性表达，这可能是造成致病机理不同的一个重要原因。为了更为精准明确心脏不同部位在心脏疾病中的不同作用，我们对心房或心室作差异性的基因修饰的新技术开发就是最为有效的动物模型。

2、目前，转基因小鼠的研发技术已非常成熟，可以做到器官或组织特异性基因敲除或过表达。但是，对于基于crispr/cas9基因编辑技术还不能做到特定部位的靶向基因修饰；而通过基因编辑工具(腺病毒/腺相关病毒aav9作为载体的基因修饰)结合特定部位的靶向注射可以突破上述瓶颈，实现特定部位的靶向基因修饰。传统的靶向组织/器官的特定部位基因修饰方法即采用原位注射，例如心肌原位多点注射技术。该技术存在的缺点是：(1)该方法需要对小鼠行开胸有创手术，并且在断第4-第5肋的基础上才可暴露心脏进行原位点注射，这一过程通常会加大小鼠的术后感染和死亡率；(2)同时为避免局部病毒浓度过高和注射不均匀，该方法需要进行多点心肌注射，由于小鼠心壁较薄，因此多点注射会增加心脏破裂的风险；(3)正常小鼠的心跳500-600跳/分钟，由于无法固定心脏，对高速跳动的心脏进行原位点注射需要非常高的技术水平，往往难以把握注射的准确部位(4)多点注射造成局部心肌细胞大量死亡，可能诱发心律失常，干扰模型的疾病应用。因此，目前心脏基因修饰主流方法多采用重组病毒的尾静脉注射，通过血液循环到达靶器官/组织。一方面从器官层次上看，通过尾静脉递送病毒载体的方式对肝脏感染效果较好，对于靶器官非肝脏的情况，这种方式对靶器官的感染效果不佳，并导致载体病毒对非靶器官的泄露，从而造成了干预的多效性，产生了非靶器官干预带来的混淆因素；另一方面考虑到器官内部存在解剖区位异质性，比如在心脏中，心肌电生理以及运动状态在心动周期种存在节段异质性，这种递送方式更无法精确靶向器官内部某一特定解剖区域，这对研究局限于特定解剖区域的疾病带来了困难。

技术实现思路

1、本发明的目的是：针对开胸原位注射实现心脏靶向基因修饰的方法存在诸多缺陷，以及针对目前流行的尾静脉递送病毒载体的方式存在脱靶，多效性干扰等问题，以及传统方法不能满足提供一种对心房或心室作差异性的基因修饰的有效的动物模型，用于探究心脏不同部位在心脏疾病中的不同作用的需求，本发明提供一种超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法。

2、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是提供一种超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法，是将携带有目的基因的编码序列、干扰序列或敲除序列的腺相关病毒稀释后，获得的病毒工作液在超声引导下，通过定点注射的方式注射于小鼠心脏特定部位，3周后目的基因在心脏注射的部位定点表达、敲低或敲除，所述小鼠为吸入异氟烷气体麻醉的小鼠。

3、优选地，所述腺相关病毒为aav9病毒。

4、优选地，所述腺相关病毒携带有心肌特异启动子ctnt。

5、优选地，所述序列携带有荧光报告基团。

6、优选地，所述注射的剂量为20-50μl，病毒滴度为1-2.5×109u。

7、本发明还提供了上述超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法在构建转基因小鼠模型中的应用，所述转基因小鼠模型为心脏不同部位具有差异性基因修饰的小鼠模型。

8、优选地，所述转基因小鼠模型包括心脏特定部位(如左心室)介导的心肌病变或心脏疾病小鼠模型。例如由心房肌或心室肌基因突变引起的特异性遗传疾病小鼠模型。

9、本发明还提供了一种转基因小鼠模型在研究心脏不同部位在心脏疾病中的作用机制中的应用，所述转基因小鼠模型的构建方法包括：

10、步骤1：腺相关病毒的制备；

11、步骤2：采用上述超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法将所述腺相关病毒转染到小鼠体内，得到转基因小鼠模型。

12、优选地，所述应用包括在研究心脏特定部位介导的心肌病变或心脏疾病的病理机制中的应用。

13、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

14、(1)本发明的超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法，定位准确，适用于构建一种对心脏不同部位(如心脏的心房、心室等不同部位)作差异性的基因修饰的有效的动物模型，能够满足用于探究心脏不同部位在心脏疾病中的不同作用的需求；

15、(2)该方法通过超声引导下穿刺技术，完成定点靶向心肌注射目的基因的同时也实现了手术微创，大大减少心肌原位注射引起的小鼠感染风险并降低术后死亡率；且不经过循环系统，削弱了病毒载体在其他非靶器官的泄露，减轻了免疫原性；

16、(3)本发明的方法通过心脏超声技术可以对需要基因注射的部位进行准确定位，实现精准的心脏部位的靶向基因修饰；避免了心脏多点注射，减少小鼠心脏出血、破裂和心律失常的发生；

17、(4)本发明的方法由于定位更为准确，可实现心脏某一特定部位的基因修饰，而不影响心脏其他部位；该方法较传统的尾静脉注射等方法，实现靶向基因修饰的同时病毒滴度的用量更低，减少病毒本身的毒副作用；

18、(5)本发明的方法能够实现有针对性的目的基因敲除或过表达，以及点突变的knockin在特定部位的表达，可以做到心脏局部定点区域的基因修饰而不影响心脏其他部位，对于研究例如心脏特定部位(如左心室)介导的心肌病变或心脏疾病等相关疾病的致病机理具有更好的特异性和精准性。

技术特征：

1.一种超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法，其特征在于，是将携带有目的基因的编码序列、干扰序列或敲除序列的腺相关病毒稀释后，获得的病毒工作液在超声引导下，通过定点注射的方式注射于小鼠心脏特定部位，3周后目的基因在心脏注射的部位定点表达、敲低或敲除，所述小鼠为吸入异氟烷气体麻醉的小鼠。

2.如权利要求1所述的超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法，其特征在于，所述腺相关病毒为aav9病毒。

3.如权利要求1所述的超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法，其特征在于，所述腺相关病毒携带有心肌特异启动子ctnt。

4.如权利要求1所述的超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法，其特征在于，所述序列携带有荧光报告基团。

5.如权利要求1所述的超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法，其特征在于，所述注射的剂量为20-50μl，病毒滴度为1-2.5×109u。

6.权利要求1～5中任意一项所述的超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法在构建转基因小鼠模型中的应用，其特征在于，所述转基因小鼠模型为心脏不同部位具有差异性基因修饰的小鼠模型。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述转基因小鼠模型包括心脏特定部位介导的心肌病变或心脏疾病小鼠模型。

8.一种转基因小鼠模型在研究心脏不同部位在心脏疾病中的作用机制中的应用，其特征在于，所述转基因小鼠模型的构建方法包括：

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，包括在研究心脏特定部位介导的心肌病变或心脏疾病的病理机制中的应用。

技术总结
本发明公开了一种超声引导下小鼠心脏定点注射基因转染的方法及应用。本发明的方法是将携带有目的基因的编码序列、干扰序列或敲除序列的腺相关病毒稀释后，获得的病毒工作液在超声引导下，通过定点注射的方式注射于小鼠心脏特定部位，3周后目的基因在心脏注射的部位定点表达、敲低或敲除，所述小鼠为吸入异氟烷气体麻醉的小鼠。本发明的方法能够实现有针对性的目的基因敲除或过表达，以及点突变的knockin在特定部位的表达，可以做到心脏局部定点区域的基因修饰而不影响心脏其他部位，对于研究例如心脏特定部位(如左心室)介导的心肌病变或心脏疾病等相关疾病的致病机理具有更好的特异性和精准性。

技术研发人员：邹云增,王时俊,陈利明,吴剑,李璇
受保护的技术使用者：复旦大学附属中山医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15