蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因在调控类黄酮合成中的应用

本发明涉及一种蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因(mtf3'h)的应用，具体涉及蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因在调控类黄酮合成中的应用，属于基因工程应用。

背景技术：

1、类黄酮(flavonoids)化合物作为一大类重要的次生代谢物产物，其广泛分布于植物的各个组织中，以及于植物细胞中也广泛存在,类黄酮是一类具有“黄烷核”基本骨架(c6-c3-c6)的多酚类化合物。类黄酮在植物界分布很广，现已发现不少于10000种，大部分与糖结合成糖苷的形式存在，少数以游离形式存在。类黄酮化合物参与发育过程的调节、抵御生物和非生物胁迫以及吸引种子传播者和传粉者。在植物中，类黄酮化合物对不同环境的胁迫进行响应，其所具有的抗氧化活性使得其在食品保健、医疗领域具有抗氧化、抗病毒、抗炎和清除自由基等功能。类黄酮不仅可以作为细胞信号传导途径中的调节因子，还能在生物胁迫和非生物胁迫中起参与作用。而花青素是植物中重要的类黄酮次生代谢产物。目前，人们生活品质的不断提高，食品的健康和营养成分(维生素、矿质元素、抗氧化物等)也已经成为人们关注的焦点。

2、在类黄酮生物合成途经，在植物黄酮合成代谢途径中起关键作用，并能够提供底物在花青素、原花青素的合成中，目前已经被证实3’羟化酶基因(f3'h)基因可以发挥重要的生理作用。目前有许多研究关于f3'h基因在花青素合成途径中的重要作用，并在不同植物中得到了验证，但f3'h基因的表达量也存在着一定的差异在不同植物中。

3、蒺藜苜蓿被用作模式植物广泛应用于植物的分子生物学以及基因组学等研究中。目前，还没有蒺藜苜蓿f3'h基因在调控类黄酮或花青素合成的研究。

技术实现思路

1、本发明的目的是提出了蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶在调控类黄酮合成中的应用的分子机理。通过对蒺藜苜蓿f3'h基因功能的了解和分析，揭示了蒺藜苜蓿f3'h基因在黄酮类化合物生物合成中的分子机制，促进了蒺藜苜蓿黄酮类化合物生物合成的研究，完善了黄酮类化合物生物合成的调控网络，促进了优良牧草的品质改良。

2、根据本申请的一个方面，提供了蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因在调控类黄酮合成中的应用，所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶的基因选自genbank：oq579034。

3、根据本申请的另一个方面，提供了蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶在调控花青素合成中的应用，所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶的基因选自genbank：oq579034。

4、具体的，所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因编码的蛋白为一种疏水性蛋白质。mtf3'h氨基酸序列中发现了四个细胞色素p450特异性保守基序和三个f3'h特异性保守基序。mtf3'h氨基酸序列与最佳定位p450酶的区域是富含脯氨酸的“铰链”区域，在c端含有血红素结合区(f442gagrricag451)(图3.6d)负责结合一氧化碳的酶；mtf3'h带有基序a306gtdts311，形成氧分子的结合袋，是其催化活性所必需的。以及mtf3'h中的e363-r366-r405三联体，以形成用于稳定核心结构的口袋锁定图案。

5、具体的，所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因编码的蛋白能够催化二氢山奈酚、柚皮素、芹黄素或山奈酚生成类黄酮类化合物。mtf3'h可以催化催化二氢山奈酚、柚皮素、芹黄素和山奈酚生成二氢槲皮素、圣草酚、木樨草素、槲皮素。

6、具体的，所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因编码的蛋白能够催化二氢山奈酚生成二氢槲皮素。mtf3'h与柚皮素、二氢山奈酚、山奈酚的km值分别为22.30、13.01和14.75μm，vmax值分别为1.92、9.91和0.86pmol·min-1。kcat/km值分别为3.65、32.35、2.49s-1，kcat/km值表明二氢山奈酚是mtf3'h的优选底物。

7、根据本申请的另一个方面，提供了一种重组载体在调控类黄酮生物合成中的应用，所述重组载体含有所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因的序列。

8、根据本申请的另一个方面，提供了一种重组工程菌在调控类黄酮生物合成中的应用，所述重组工程菌包含所述重组载体，所述重组载体含有所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因的序列。

9、在一些具体实施方案中，所述宿主菌为酵母菌。

10、本发明的有益效果为：

11、1、本发明的研究结果表明，mtf3'h蛋白具有黄酮类3’-羟化酶的功能，对山奈酚、二氢山奈酚、柚皮素和芹菜素这四种黄酮类底物具有活性。微粒体蛋白酶动力学分析表明，对柚皮素、山奈酚、和二氢山奈酚三种底物的表观km值为22.30μm、13.01μm和14.75μm，vmax值为1.92pmol·min-1、9.91pmol·min-1和0.86pmol·min-1，kcat/km值分别为3.65s-1、32.35s-1、2.49s-1，kcat/km值表明二氢山奈酚是mtf3'h的优选底物。当mtf3'h基因在蒺藜苜蓿突变体nf1480和野生型r108毛状根中过表达时，与对照毛状根相比，花青素含量显著增加，表明mtf3'h在体内具有功能。上述的研究结果表明mtf3'h在蒺藜苜蓿类黄酮生物合成途径中具有重要作用。

12、2、本发明首次在蒺藜苜蓿类黄酮合成途径中证明了mtf3'h基因的重要性，也使蒺藜苜蓿的类黄酮化合物生物合成途径更加完善，推动研究关于mtf3'h基因功能的进展，提供改良苜蓿品质的分子基础。

技术特征：

1.蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因在调控类黄酮合成中的应用，其特征在于，所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶的基因选自genbank：oq579034。

2.蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶在调控花青素合成中的应用，其特征在于，所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶的基因选自genbank：oq579034。

3.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因编码的蛋白为一种疏水性蛋白质。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶编码的蛋白能够催化二氢山奈酚、柚皮素、芹黄素或山奈酚生成类黄酮类化合物。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶编码的蛋白能够催化二氢山奈酚生成二氢槲皮素。

6.一种重组载体在调控类黄酮生物合成中的应用，其特征在于，所述重组载体含有所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因的序列。

7.一种重组工程菌在调控类黄酮生物合成中的应用，其特征在于，所述重组工程菌包含所述重组载体，所述重组载体含有所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因的序列。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述宿主菌为酵母菌。

技术总结
本发明提供了一种蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶基因在调控类黄酮合成中的应用，所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶的基因选自GenBank：OQ579034。所述蒺藜苜蓿类黄酮3’羟化酶编码的蛋白能够催化二氢山奈酚、柚皮素、芹黄素或山奈酚生成类黄酮类化合物。本发明的研究结果表明，MtF3'H蛋白具有黄酮类3’‑羟化酶的功能，对山奈酚、二氢山奈酚、柚皮素和芹菜素这四种黄酮类底物具有活性。本发明首次在蒺藜苜蓿类黄酮合成途径中证明了MtF3'H基因的重要性，也使蒺藜苜蓿的类黄酮化合物生物合成途径更加完善，推动研究关于MtF3'H基因功能的进展，提供改良苜蓿品质的分子基础。

技术研发人员：庞永珍,阎肃
受保护的技术使用者：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16