一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针及其制备方法和应用

本发明属于溶酶体ph检测，涉及一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、除了消化和降解细胞内的废物外，溶酶体还可以通过释放代谢物和离子来感应细胞内的代谢和营养稳态，在信号传递和营养传感中发挥重要的作用。然而，溶酶体的这些功能高度依赖于其ph值。例如溶酶体ph的异常升高会对溶酶体的消化产生广泛的影响，既能抑制与溶酶体ph环境匹配的水解酶的活性，也能提高最适ph值接近中性的其他水解酶的活性。这种转变将促进底物消化不良或/和非典型降解，可能产生有毒的消化产物或/和部分未消化的中间体。有文献报道，即使溶酶体的ph增加十分之几的ph单位，也足以抑制关键溶酶体蛋白水解酶和脂肪酶的活性。更重要的是，这种碱化与癌症和神经退行性疾病(如阿尔茨海默病和帕金森病)密切相关。因此，准确监测活细胞中溶酶体微酸性环境的微碱化尤为重要。

2、到目前为止，人们开发出许多方法来监测溶酶体ph的变化，包括电化学方法、扫描电化学显微镜法、核磁共振法和荧光探针法。其中，荧光探针法由于具有非侵入性、高灵敏度、超空间成像和易于使用的特点而成为监测溶酶体ph的首选方法。近年来，基于罗丹明、萘酰亚胺、香豆素、吲哚类和苯并吡喃酮等多种溶酶体靶向的ph荧光探针被相继合成并成功应用于细胞内溶酶体ph的检测中。然而，这些荧光探针的pka值低、溶解性差且易发生荧光漂白的现象。例如，以罗丹明b构建的ph荧光探针在环境中的ph升高或接近中性时，由于螺环基团的闭合而造成荧光淬灭，因而不太适合用于溶酶体微酸性环境中轻微碱化的检测。此外，ph荧光探针的低pka值必然造成对ph的低敏感性，其对溶酶体具有强烈的“碱化作用”，也不适合监测溶酶体的碱化。综上所述，理想的ph荧光探针仍然非常稀缺。因此，开发一种能监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的新型荧光探针具有十分重大的意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针；本发明的目的之二在于提供一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针在溶酶体ph检测或溶酶体成像方面的应用。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1.一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针，所述荧光探针的结构式如下所示：

4、

5、2.所述的一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针的制备方法，所述制备方法如下：

6、(1)制备化合物1：将4-溴-1,8-萘二甲酸酐溶于乙醇中，然后加入2-氨基乙醇，于85℃下搅拌回流4h后自然冷却至室温，经过滤、乙醇洗涤后于50℃下减压烘干即可获得化合物1；

7、所述化合物1的结构式如下所示：

8、

9、(2)制备监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针(b26)：将步骤(1)中所述化合物1溶解于二甲基亚砜中，然后依次加入n-(2-羟乙基)哌嗪和碱性物质，混合均匀后于90℃下反应4h，反应结束后自然冷却至室温获得反应产物，所述反应产物经去离子水洗涤、过滤获得沉淀，再向所述沉淀中加入去离子水和乙酸乙酯，混合均匀后过滤，于50℃减压烘干即可获得监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针；

10、所述碱性物质为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、碳酸铯、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钙、四丁基氢氧化铵、四丁基碳酸铵或叔丁醇钾中的任意一种。

11、优选的，步骤(1)中所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐和2-氨基乙醇的摩尔比为5:6。

12、优选的，步骤(2)中所述化合物1、n-(2-羟乙基)哌嗪和碱性物质的摩尔比为1:1.2:3～10。

13、进一步优选的，步骤(2)中所述化合物1、n-(2-羟乙基)哌嗪和碱性物质的摩尔比为1:1.2:3～5。

14、优选的，步骤(2)中所述去离子水和乙酸乙酯的体积比为1:1。

15、3.所述的一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针在溶酶体ph检测或溶酶体成像方面的应用。

16、本发明的有益效果在于：本发明提供了一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针。该荧光探针(b26)属于萘二亚胺类化合物，在酸性条件下，结构中哌嗪上的n原子被质子化后阻碍了b26-h+分子内的电子转移，光诱导电子转移(pet)效应被抑制，使得b26产生了荧光。实验结果表明，b26在弱酸性至弱碱性溶液中的荧光强度随ph的降低而显著增强，并在ph＝5.7～8.1的范围内呈良好的线性相关。进一步地将其用于活细胞中溶酶体ph的监测，表现出了与溶液一致的ph响应特性，即b26在酸性、中性及弱碱性条件下荧光处于开启状态，细胞显色；在较强碱性条件下荧光处于关闭状态，细胞不显色。同时由于b26的pka值高，不仅避免了罗丹明b类化合物在ph接近中性时由于螺内环关闭而造成荧光淬灭，还避免了低pka值的荧光探针对溶酶体强烈的“碱化”作用，再结合其光稳定性、响应性以及可逆性良好，对h+高度选择，且具有良好的生物相容性和溶酶体标记特异性，从而在活细胞中溶酶体轻微碱化的良好监测以及成像中具有巨大的应用前景。

17、本发明还提供了一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针的制备方法。该荧光探针经4-溴-1,8-萘二甲酸酐与2-氨基乙醇反应后，再由n-(2-羟乙基)哌嗪进行溴取代制备而成。制备过程简单易操作，适合扩大化生产。

18、本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

技术特征：

1.一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的结构式如下所示：

2.权利要求1所述的一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述制备方法如下：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述4-溴-1,8-萘二甲酸酐和2-氨基乙醇的摩尔比为5:6。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述化合物1、n-(2-羟乙基)哌嗪和碱性物质的摩尔比为1:1.2:3～10。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述去离子水和乙酸乙酯的体积比为1:1。

6.权利要求1所述的一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针在溶酶体ph检测或溶酶体成像方面的应用。

技术总结
本发明涉及一种监测溶酶体微酸性环境轻微碱化的荧光探针及其制备方法和应用，属于溶酶体pH检测技术领域。该荧光探针(B26)为萘二酰亚胺类化合物，经4‑溴‑1,8‑萘二甲酸酐与2‑氨基乙醇反应后，再由N‑(2‑羟乙基)哌嗪进行溴取代制备而成。实验结果表明，B26的荧光强度在pH为5.7～8.1的范围内呈良好的线性相关，且光稳定性、响应性以及可逆性优异，对H<supgt;+</supgt;高度选择，因此通过测试其荧光强度便可实现对细胞内溶酶体pH的监测。此外，B26具有良好的生物相容性，能够对溶酶体特异性标记，从而在溶酶体的成像中具有巨大的应用前景。

技术研发人员：刘倩,甘勇军,徐芷琪,杨佳琪,杨鹏丽
受保护的技术使用者：重庆医科大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16