一种含小片段的DNA分子量标准物及其生产方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及一种含小片段的dna分子量标准物及其生产方法。

背景技术：

1、在进行电泳的时候，一般会使用相应的dna分子量标准物(本文有时简称为“marker”)作为参照，其中最常见的是dna marker，当然，还有一些是蛋白质marker、rnamarker等。

2、dna marker的生产工艺，只有一小部分十分简单的marker可以省略条带配比过程，比如λ-hindⅲdigest，酶切后经纯化可直接用于配置marker，其他的绝大多数dnamarker都需要按照其条带分布特点，采用pcr、质粒酶切等方式产生相应组分，纯化后按照部分条带的定量分析结果以一定比例进行配比，之后再进行marker的配置，加入缓冲液、甘油、染料等形成可以使用的marker。这样存在的问题是：很多条带需要单独进行定量，之后按照一定比例进行混合，由于是对其中部分条带进行单独定量，存在定量误差，其批次间的稳定性较差，质量难以保证，因此急需一种简单的生产工艺。

3、此外，使用酶切法进行质粒制作的另外一个问题就是分子克隆最常见的抗性基因编码区长度大于800bp，其中又不含任何常见的酶切位点，比如bamh i、ecor v、hindⅲ等，因此在设计时无法在氨苄抗性基因编码区内部进行切割，对设计的灵活性具有极大的限制，也迫使酶切法生产marker时使用更复杂的工艺。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的至少部分问题，发明人通过改造分子克隆常用载体上的氨苄青霉素抗性基因的编码区，在保持活性的前提下使其具有常见限制性内切酶酶切位点，能够使marker的制作时不受基因长度的限制，可以省去复杂的条带配比过程，只对其总量进行测量即可，使marker生产变得简单高效，同时增加了批次间的稳定性。具体地，本发明包括以下内容。

2、本发明的第一方面，提供一种含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其包括以下步骤：

3、(1)在含有氨苄青霉素的培养基中使宿主细胞进行复制培养，其中，所述宿主细胞中的质粒包含改良型氨苄青霉素抗性基因；

4、(2)从培养得到的宿主细胞中提取质粒；

5、(3)酶切所述质粒，得到不同分子量的标准物。

6、在某些实施方案中，根据本发明所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，进一步包括根据酶切后的产物按配比进行混合的步骤。

7、在某些实施方案中，根据本发明所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其中，所述基因含有经改造的氨苄青霉素抗性基因的编码区，所述经改造的编码区内含有至少一种内切酶酶切位点。

8、在某些实施方案中，根据本发明所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其中，所述内切酶酶切位点包括限制性内切酶bamh i酶切位点和/或ecor v酶切位点。

9、在某些实施方案中，根据本发明所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其中，所述质粒具有seq id no.4和/或seq id no.5所示的序列。

10、在某些实施方案中，根据本发明所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其中，所述dna分子量标准物含有不同大小的片段，且至少部分片段为1000bp以下。

11、在某些实施方案中，根据本发明所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

12、在某些实施方案中，根据本发明所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其中，使用bamh i和/或ecor v进行酶切。

13、本发明的第二方面，提供一种含小片段的dna分子量标准物，其根据第一方面所述的方法得到。

14、本发明的第三方面，提供一种核酸检测或定量试剂盒，其包括本发明所述的含小片段的dna分子量标准物。

15、本发明通过改造分子克隆常用载体上的氨苄青霉素抗性基因的编码区，在保持活性的前提下使其具有常见限制性内切酶酶切位点，使其用于marker的制作时不受基因长度的限制。此外，使用上述含常用内切酶酶切位点的氨苄抗性基因编码区作为基础，构建质粒，按照本发明的生产方法，可以省去复杂的条带配比过程，只对其总量进行测量即可，使marker生产变得简单高效，同时增加了批次间的稳定性。

技术特征：

1.一种含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其特征在于，进一步包括根据酶切后的产物按配比进行混合的步骤。

3.根据权利要求1所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其特征在于，所述基因含有经改造的氨苄青霉素抗性基因的编码区，所述经改造的编码区内含有至少一种内切酶酶切位点。

4.根据权利要求3所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其特征在于，所述内切酶酶切位点包括限制性内切酶bamh i酶切位点和/或ecorv酶切位点。

5.根据权利要求1所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其特征在于，所述质粒具有seq id no.4和/或seq id no.5所示的序列。

6.根据权利要求1所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其特征在于，所述dna分子量标准物含有不同大小的片段，且至少部分片段为1000bp以下。

7.根据权利要求1所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

8.根据权利要求1所述的含小片段的dna分子量标准物的生产方法，其特征在于，使用bamh i和/或ecor v进行酶切。

9.一种含小片段的dna分子量标准物，其特征在于，根据权利要求1-8任一项所述的方法得到。

10.一种核酸检测或定量试剂盒，其特征在于，其包括权利要求9所述的含小片段的dna分子量标准物。

技术总结
本发明公开一种含小片段的DNA分子量标准物及其生产方法。本发明通过改造分子克隆常用载体上的氨苄青霉素抗性基因的编码区，在保持活性的前提下使其具有常见限制性内切酶酶切位点，从而在用于Marker的生产时不受基因长度的限制。此外，使用上述含常用内切酶酶切位点的氨苄抗性基因编码区作为基础，构建质粒，按照本发明的生产方法，可以省去复杂的条带配比过程，只对其总量进行测量即可，使Marker生产变得简单高效，同时增加了批次间的稳定性。

技术研发人员：纪鑫,王伟伟,田埂
受保护的技术使用者：北京元码医学检验实验室有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16