一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法和应用与流程

本发明涉及干细胞，具体为一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法和应用。

背景技术：

1、间充质干细胞来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，间充质干细胞最初在骨髓中被发现，间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注，成纤维细胞是疏松缔结组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来，对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用，在现有的成纤维细胞制备方法中，是先由皮肤中提取成纤维细胞，然后采用酶消化法或者组织块法进行体外培养，但单纯的组织块法具有周期较长的缺点，不利于生产，单纯的酶消化所产出的成纤维细胞活性较差，不利于胶原纤维和基质成分的分泌；现有的成纤维细胞制备方法，在培育过程中难以使成纤维细胞大量增殖，导致制备效率不高；现有的成纤维细胞大多用于修复不同程度的细胞变性、坏死或者组织缺损，应用范围较窄。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法和应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法和应用，包括以下步骤：步骤一，原料获取；步骤二，原代培养；步骤三，诱导分化；步骤四，传代培养；步骤五，择优冻存；步骤六，诱导成骨；

3、其中在上述步骤一中，取健康人类胎儿的脐带组织，将其表面的污血洗净，然后剪成2-3cm小段，将每个组织小段中的动脉血管与静脉血管取出，将其剪碎后得到脐带组织块；

4、其中在上述步骤二中，取步骤一中得到的脐带组织块，将其放入dmem/f12培养基中，并采用组织贴壁法进行培养，然后使用胰蛋白酶溶液进行浸泡，超声震荡处理浸泡后的溶液，之后静置一段时间，取其上清液，得到所需的间充质干细胞组织液，并将其分瓶保存；

5、其中在上述步骤三中，取步骤二中得到的间充质干细胞组织液，将其移至新的dmem/f12培养基中，并向其中加入内皮细胞和周细胞组织液进行诱导培养，获得含有成纤维细胞的组织液；

6、其中在上述步骤四中，取步骤三中含有成纤维细胞的组织液，将其移至新的dmem/f12培养基中，然后加入适量氨基酸与前胶原肽酶混合，并模拟皮肤表皮信号对其进行刺激，培养一段时间；

7、其中在上述步骤五中，选择生长旺盛的成纤维细胞组织液并再次使用超声震荡进行处理，取组织液的上清液，得到成纤维细胞提取物，进行冻存处理；

8、其中在上述步骤六中，需要使用时将纤维细胞提取物解冻复苏，并在培养基上加入诱导因素，然后与合适的生物材料载体进行复合，使其在体外环境下保持一定的成骨能力。

9、优选的，所述步骤一中，健康人类胎儿的脐带组织可用恒河猴皮肤或鸡胚的提取物代替。

10、优选的，所述步骤二中，脐带组织块培养至2-3代即可停止，胰蛋白酶溶液中可加入部分的胶原蛋白酶。

11、优选的，所述步骤二中，采用组织块法则大约在接种后2～6天左右，在接种的皮肤组织块周围长出细胞，待细胞融合成片，铺满培养容器底壁大部分时即可进行提取。

12、优选的，所述步骤三中，内皮细胞和周细胞之间采用基膜连接，基膜碰上包括多种整合素、神经钙黏素、纤连蛋白和接合素，且二者通过间隙连接进行联系，以此调控成纤维细胞的增殖。

13、优选的，所述步骤四中，氨基酸选自赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸中的一种或几种。

14、优选的，所述步骤四中，成纤维细胞悬液在接种后5～10min即可见细胞以伪足初期附着，与底物形成一些接触点，然后细胞逐渐呈放射状伸展，胞体的中心部分亦随之变扁平，大约在接种后30min，细胞贴附底物即较为完全，呈现成纤维细胞的形态。

15、优选的，所述步骤五中，成纤维细胞需要在培养基中培养8-10代后才能进行提取。

16、本发明还提供一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法获得的成纤维细胞提取物制备骨组织的应用，进行一定程度的成骨后，获得具有一定的生物力学支撑强度而成骨作用又保持活跃的“活骨”复合体，用以替代自体骨或异体骨回植体内治疗难以自身修复的较大的骨缺损。

17、与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明相较于现有的成纤维细胞制备方法，通过使用间充质干细胞诱导分化成纤维细胞，结合组织块法和酶消化法，加快了成纤维细胞的培养速度，且保证了成纤维细胞的活性；本发明通过加入氨基酸与前胶原肽酶，并模拟皮肤表皮信号刺激成纤维细胞，提高了成纤维细胞增殖效率；本发明通过加入上皮细胞、tng-α和bmp等诱导因素，使成纤维细胞可以有效应用于骨缺损修复中。

技术特征：

1.一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法，包括以下步骤：步骤一，原料获取；步骤二，原代培养；步骤三，诱导分化；步骤四，传代培养；步骤五，择优冻存；步骤六，诱导成骨；其特征在于：

2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法，其特征在于：所述步骤一中，健康人类胎儿的脐带组织可用恒河猴皮肤或鸡胚的提取物代替。

3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法，其特征在于：所述步骤二中，脐带组织块培养至2-3代即可停止，胰蛋白酶溶液中可加入部分的胶原蛋白酶。

4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法，其特征在于：所述步骤二中，采用组织块法则大约在接种后2～6天左右，在接种的皮肤组织块周围长出细胞，待细胞融合成片，铺满培养容器底壁大部分时即可进行提取。

5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法，其特征在于：所述步骤三中，内皮细胞和周细胞之间采用基膜连接，基膜碰上包括多种整合素、神经钙黏素、纤连蛋白和接合素，且二者通过间隙连接进行联系，以此调控成纤维细胞的增殖。

6.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法，其特征在于：所述步骤四中，氨基酸选自赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸中的一种或几种。

7.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法，其特征在于：所述步骤四中，成纤维细胞悬液在接种后5～10min即可见细胞以伪足初期附着，与底物形成一些接触点，然后细胞逐渐呈放射状伸展，胞体的中心部分亦随之变扁平，大约在接种后30min，细胞贴附底物即较为完全，呈现成纤维细胞的形态。

8.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法，其特征在于：所述步骤五中，成纤维细胞需要在培养基中培养8-10代后才能进行提取。

9.一种由权利要求1-8所述的间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法获得的成纤维细胞提取物制备骨组织的应用，其特征在于：进行一定程度的成骨后，获得具有一定的生物力学支撑强度而成骨作用又保持活跃的“活骨”复合体，用以替代自体骨或异体骨回植体内治疗难以自身修复的较大的骨缺损。

技术总结
本发明公开了一种间充质干细胞诱导成纤维细胞制备方法和应用，包括步骤一，原料获取；步骤二，原代培养；步骤三，诱导分化；步骤四，传代培养；步骤五，择优冻存；步骤六，诱导成骨；所述步骤一中，健康人类胎儿的脐带组织可用恒河猴皮肤或鸡胚的提取物代替，本发明相较于现有的成纤维细胞制备方法，使用间充质干细胞诱导分化成纤维细胞，结合组织块法和酶消化法，加快了成纤维细胞的培养速度，保证了成纤维细胞的活性；本发明通过加入氨基酸与前胶原肽酶、模拟皮肤表皮信号刺激成纤维细胞，提高了成纤维细胞增殖效率；本发明通过加入上皮细胞、TNG‑α和BMP等诱导因素，使成纤维细胞可以有效应用于骨缺损修复中。

技术研发人员：易科青,罗志勇,方超
受保护的技术使用者：深圳润生元生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15