NGS单链文库、其构建方法及构建试剂盒与流程

本发明涉及测序文库构建，具体而言，涉及一种ngs单链文库、其构建方法及构建试剂盒。

背景技术：

1、在dna检测过程中，dna片段的利用效率都是第一重要的问题。在双链建库时需要末端补平和加a，由于加a和磷酸化效率的限制，所以很难达到理想的文库转化效率。在实际操作过程中，通常只有大概10-50％的文库能够被转化成有效文库。其中，超声打断的ffpe样本转化效率最低，转化效率一般在10-20％；cfdna和pcr片段的文库转化效率比较理想，在20-50％。所以在比较重要的dna检测过程中需要更有效的建库方案解决文库转化效率低的问题。

2、目前，在肿瘤的早期诊断和早期筛查中dna的甲基化是重要的生物标志物信号。由于这种标志物信号要用亚硫酸氢盐转化，而亚硫酸氢盐在处理时会产生dna损伤，所以目前用的比较多的是swift公司的专利(cn_104395480_b)的单链建库产品。虽然这个专利解决了部分问题，单加尾可以解决建库效率提升的问题，但是还不是效率最高的方法，因为只有一端是单加尾连接，另一端还是双链连接。在解决连接效率方面燃石用了一种单加尾后的反复二链扩增后的第二链单加尾连接(cn_110892097_a)。

3、虽然swift和燃石解决了建库过程中的文库转化效率问题，但是没有关注加接头可能会影响甲基化信号检测准确性的问题，由于甲基化检测的评估是用c转化成t来评估的，所以在加接头被测链有这个两个碱基都会影响分析。

技术实现思路

1、本发明旨在提供一种ngs单链文库、其构建方法及构建试剂盒，以提高甲基化检测的准确性或测序质量。

2、为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种ngs单链文库的构建方法。该构建方法包括：s1，当ngs单链文库为甲基化测序文库时，待测目的片段被测链端加g尾和/或a尾；或当ngs单链文库为非甲基化测序文库时，待测目的片段被测链端加c尾和/或t尾；s2，将测序文库接头与s1中获得到的被测链端加尾的待测目的片段连接完成ngs单链文库的构建。

3、进一步地，ngs单链文库的构建采用双加尾的方式。

4、进一步地，当测序平台为illumina测序平台时，ngs单链文库为甲基化测序文库，待测目的片段被测链端p5至p7方向5’至3’加g尾和a尾，a尾和g尾，g尾和g尾，或a尾和a尾；优选为g尾和a尾，或g尾和g尾；ngs单链文库为非甲基化测序文库，待测目的片段被测链端p5至p7方向5’至3’加c尾和t尾，或t尾和c尾。

5、进一步地，当测序平台为mgi测序平台时，ngs单链文库为甲基化测序文库，待测目的片段被测链端标签2到标签1的方向5’至3’加g尾和a尾，a尾和g尾，g尾和g尾，或a尾和a尾；优选为g尾和a尾，或g尾和g尾；其中，agttnnnnnnnnnncaac的agtt---caac8个碱基中间的10个碱基是标签2；acaannnnnnnnnnctga的acaa---ctga8个碱基中间的10个碱基是标签1，具体的，标签2可以是cn111910258中的标签2编号序列，标签1可以是cn111910258中的标签1编号序列；ngs单链文库为非甲基化测序文库，待测目的片段被测链端标签2到标签1的方向5’至3’加c尾和t尾，或t尾和c尾。

6、进一步地，g尾、a尾、c尾或t尾的长度为5～25个碱基。

7、进一步地，s1包括，通过末端加尾辅助子在待测目的片段被测链端加尾。

8、根据本发明的另一个方面，提供一种ngs单链文库。该ngs单链文库由上述任一种ngs单链文库的构建方法构建而成。

9、根据本发明的再一个方面，提供一种ngs单链文库构建试剂盒。该ngs单链文库构建试剂盒包括：末端加尾辅助子。

10、进一步地，当测序平台为illumina测序平台时，ngs单链文库为甲基化测序文库，末端加尾辅助子包括在p7端加g尾的末端加尾辅助子、在p7端加a尾的末端加尾辅助子、在p5端加t尾的末端加尾辅助子和在p5端加c尾的末端加尾辅助子；

11、优选的，在p7端加g尾的末端加尾辅助子由引物seq id no:5与seq id no:2退火形成；

12、优选的，在p7端加a尾的末端加尾辅助子由引物seq id no:3与seq id no:2退火形成；

13、优选的，在p5端加c尾的末端加尾辅助子由引物seq id no:4与seq id no:9退火形成；

14、优选的，在p5端加t尾的末端加尾辅助子由引物seq id no:1与seq id no:9退火形成。

15、进一步地，当测序平台为illumina测序平台时，ngs单链文库为非甲基化测序文库，末端加尾辅助子包括在p7端加c尾的末端加尾辅助子、在p7端加t尾的末端加尾辅助子、在p5端加a尾的末端加尾辅助子和在p5端加g尾的末端加尾辅助子；

16、优选的，在p7端加c尾的末端加尾辅助子由引物seq id no:4与seq id no:2退火形成；

17、优选的，在p7端加t尾的末端加尾辅助子由引物seq id no:1与seq id no:2退火形成；

18、优选的，在p5端加a尾的末端加尾辅助子由引物seq id no:3与seq id no:9退火形成；

19、优选的，在p5端加g尾的末端加尾辅助子由引物seq id no:5与seq id no:9退火形成。

20、进一步地，当测序平台为mgi测序平台时，ngs单链文库为甲基化测序文库，末端加尾辅助子包括：

21、末端加a的辅助子由引物seq id no:10与seq id no:11退火形成；

22、末端加g的辅助子由引物seq id no:15与seq id no:11退火形成；和

23、末端加c的辅助子由引物seq id no:13与seq id no:14退火形成。

24、进一步地，当测序平台为mgi测序平台时，ngs单链文库为非甲基化测序文库，末端加尾辅助子包括：

25、末端加c的辅助子由引物seq id no:16与seq id no:11退火形成；

26、末端加a的辅助子由引物seq id no:17与seq id no:14退火形成；

27、末端加t的辅助子由引物seq id no:18与seq id no:11退火形成；和

28、末端加g的辅助子由引物seq id no:19与seq id no:14退火形成。

29、应用本发明的技术方案，在甲基化的检测过程中，加尾是综合考虑了文库转化效率、测序质量和分析准确性三个维度测试出的最佳方案来解决肿瘤早筛/早诊的甲基化信号的微小变化差异。

技术特征：

1.一种ngs单链文库的构建方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述ngs单链文库的构建采用双加尾的方式。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，当测序平台为illumina测序平台时，

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，当测序平台为mgi测序平台时，

5.根据权利要求1至4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述g尾、a尾、c尾或t尾的长度为5～25个碱基。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述s1包括，通过末端加尾辅助子在所述待测目的片段被测链端加尾。

7.一种ngs单链文库，其特征在于，由权利要求1至6中任一项所述的ngs单链文库的构建方法构建而成。

8.一种ngs单链文库构建试剂盒，其特征在于，包括：末端加尾辅助子。

9.根据权利要求8所述的ngs单链文库构建试剂盒，其特征在于，当测序平台为illumina测序平台时，ngs单链文库为甲基化测序文库，所述末端加尾辅助子包括在p7端加g尾的末端加尾辅助子、在p7端加a尾的末端加尾辅助子、在p5端加t尾的末端加尾辅助子和在p5端加c尾的末端加尾辅助子；

10.根据权利要求8所述的ngs单链文库构建试剂盒，其特征在于，当测序平台为illumina测序平台时，ngs单链文库为非甲基化测序文库，所述末端加尾辅助子包括在p7端加c尾的末端加尾辅助子、在p7端加t尾的末端加尾辅助子、在p5端加a尾的末端加尾辅助子和在p5端加g尾的末端加尾辅助子；

11.根据权利要求8所述的ngs单链文库构建试剂盒，其特征在于，当测序平台为mgi测序平台时，ngs单链文库为甲基化测序文库，所述末端加尾辅助子包括：

12.根据权利要求8所述的ngs单链文库构建试剂盒，其特征在于，当测序平台为mgi测序平台时，ngs单链文库为非甲基化测序文库，所述末端加尾辅助子包括：

技术总结
本发明公开了一种NGS单链文库、其构建方法及构建试剂盒。该构建方法包括：S1，当NGS单链文库为甲基化测序文库时，待测目的片段被测链端加G尾和/或A尾；或当NGS单链文库为非甲基化测序文库时，待测目的片段被测链端加C尾和/或T尾；S2，将测序文库接头与S1中获得到的被测链端加尾的待测目的片段连接完成NGS单链文库的构建。应用本发明的技术方案，在甲基化的检测过程中，加尾是综合考虑了文库转化效率、测序质量和分析准确性三个维度测试出的最佳方案来解决肿瘤早筛/早诊的甲基化信号的微小变化差异。

技术研发人员：胡玉刚,章明晔,肖力
受保护的技术使用者：纳昂达（南京）生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16