本发明涉及分子生物学,具体涉及检测神经鞘瘤的基因集及其多重pcr-高通量测序检测试剂盒。
背景技术:
1、神经纤维瘤2型与神经鞘瘤的致病基因完全不同,但表型多有重叠,基因检测是对它们进行鉴别诊断至关重要的手段,目前主要的基因检测方法包括全基因组测序、全外显子组测序、靶向基因高通量测序等,其中全基因组测序、全外显子组测序分别覆盖了全基因组序列与全部基因的外显子(编码区)序列,覆盖范围广,检测基因多,但成本较高,价格昂贵,同时大量的意义不明的基因位点解读困难,靶向基因捕获测序,针对特定基因的特定区域,目标明确,可快速得到相关基因突变位点,且成本较低,适用于临床实践。捕获的技术路线又包括液相捕获与多重pcr扩增等,液相捕获成本较高,实验复杂,适用于靶标区域较大的情况,而多重pcr扩增具有实验简单,快速,同时成本可控的特点,但多重引物的设计与体系调整是难点。
技术实现思路
1、为此,本发明提供检测神经鞘瘤的基因集及其多重pcr-高通量测序检测试剂盒,以解决现多重引物的设计与体系调整难的问题。本发明的目的是提供一种检测神经鞘瘤相关基因的多重pcr-高通量检测试剂盒,助力临床诊断。
2、为了实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
3、根据本发明第一方面提供的一种用于检测神经鞘瘤的基因集,包含一个或两个以上如下基因的组合:dgcr8/coq6/cdkn2a/cdkn2b/smarca4的蛋白编码区域与侧翼可变剪接区域;nf2/lztr1/smarcb1的蛋白编码区域与侧翼可变剪接区域、绝大部分utr、启动子区域与内含子内可能导致剪接效应的区域;覆盖上述基因已报道的所有致病或可能致病的snv/indel。
4、根据本发明第二方面提供的一种神经鞘瘤基因检测用引物组合物,所述组合物包括第一轮与神经鞘瘤相关基因集引物加上20bp的序列。
5、进一步的,引物上游f序列加上acacgacgctcttccgatct(如序列表seq id no.1所示),引物下游r序列加上gacgtgtgctcttccgatct(如序列表seq id no.2所示)。
6、进一步的,所述引物还包括第二轮引物:
7、f:
8、aatgatacggcgaccaccgagatctacacnnnnnnnnacactctttccctacacgacgctcttccgatct;如序列表seq id no.3所示;
9、r:
10、caagcagaagacggcatacgagatnnnnnnnngtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct;如序列表seq id no.4所示;
11、其中,nnn代表测序index序列。
12、根据本发明第三方面提供的一种用于检测神经鞘瘤的检测试剂盒,包括如上所述的神经鞘瘤基因检测用引物组合物。
13、进一步的,包括两个pool进行多重pcr。
14、进一步的,其特征在于,pcr扩增体系为:
15、
16、进一步的,第一轮pcr扩增程序为:第一轮pcr扩增程序:95℃,2min;(98℃,20s;65℃,1min;72℃,30s)×16cycles;72℃,3min;4℃,∞;
17、第二轮pcr扩增程序:95℃,2min;(98℃,20s;65℃,1min;72℃,30s)×10cycles;72℃,3min;4℃,∞。
18、本发明具有如下优点:
19、本发明通过使用多重pcr靶向捕获技术和高通量二代测序技术进行神经鞘瘤相关基因检测。该方法是指利用多重pcr技术,同时对基因组dna上的多个目标区域进行扩增得到扩增子,然后通过pcr的方式将二代测序接头添加到扩增子的两侧,得到扩增子文库,进行二代测序,获取目标区域的序列信息,并进行snv/indel鉴定,本方法覆盖相关基因dgcr8/coq6/cdkn2a/cdkn2b/smarca4的蛋白编码区域与侧翼可变剪接区域,nf2/lztr1/smarcb1的蛋白编码区域与侧翼可变剪接区域、绝大部分utr、启动子区域与内含子内可能导致剪接效应的区域,覆盖上述基因已报道的所有致病或可能致病的snv/indel。此法在保证扩增均一性的前提下,对数百个区域进行快速靶向线性扩增后,使用国产自主研发测序平台(genolab)进行大批量样本平行检测和基于生物信息学方法的数据深度分析。基于多参数引物设计,极大地提高了捕获效率并降低漏检率,降低成本的同时,提高临床检出率,适用于神经鞘瘤的临床诊疗。
20、本发明的试剂盒的基因集是对数据库进行筛选,针对相关基因蛋白编码外显子区域与目前已知的神经鞘瘤致病位点以及潜在可能的可变剪接致病位点进行设计,通过特异性的多重pcr引物,实现全面覆盖,具有操作简单,成本可控,可满足神经鞘瘤的临床诊疗需求,同时可发现区域内新的致病位点。
1.一种用于检测神经鞘瘤的基因集,其特征在于,包含一个或两个以上如下基因的组合:dgcr8/coq6/cdkn2a/cdkn2b/smarca4的蛋白编码区域与侧翼可变剪接区域;nf2/lztr1/smarcb1的蛋白编码区域与侧翼可变剪接区域、绝大部分utr、启动子区域与内含子内可能导致剪接效应的区域;覆盖上述基因已报道的所有致病或可能致病的snv/indel。
2.一种神经鞘瘤基因检测用引物组合物,其特征在于,所述组合物包括第一轮与神经鞘瘤相关基因集引物加上20bp的序列。
3.根据权利要求2所述的一种神经鞘瘤基因检测用引物组合物,其特征在于,引物上游f序列加上acacgacgctcttccgatct,如序列表seq id no.1所示,引物下游r序列加上gacgtgtgctcttccgatct,如序列表seq id no.2所示。
4.根据权利要求2所述的一种神经鞘瘤基因检测用引物组合物,其特征在于,所述引物还包括第二轮引物:
5.一种用于检测神经鞘瘤的检测试剂盒,其特征在于,包括如权利要求2-4中任一所述的神经鞘瘤基因检测用引物组合物。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测神经鞘瘤的检测试剂盒,其特征在于,包括两个pool进行多重pcr。
7.根据权利要求6所述的一种用于检测神经鞘瘤的检测试剂盒,其特征在于,其特征在于,pcr扩增体系为:
8.根据权利要求7所述的一种用于检测神经鞘瘤的检测试剂盒,其特征在于,其特征在于,第一轮pcr扩增程序为:第一轮pcr扩增程序:95℃,2min;(98℃,20s;65℃,1min;72℃,30s)×16cycles;72℃,3min;4℃,∞;