一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷M2的方法

本发明涉及一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷m2的方法，属于生物催化合成。

背景技术：

1、甜菊糖苷是从甜叶菊叶子中提取和纯化的二萜糖苷，具有高甜度、低热量、对人体无副作用等优点。甜菊糖苷已被美国、巴西、韩国、日本和欧洲食品安全局批准为安全食品添加剂。到目前为止，已从甜菊叶中鉴定出64种甜菊醇糖苷，其中，甜菊糖含量最高，占干重的5-10％，其次是莱鲍迪苷a，占干重的2-4％。他们表现出比蔗糖高250-300倍的甜度，但即使是高纯度的甜菊糖苷也保留了苦味的属性，这在很大程度上限制了它们在天然食品添加剂市场中的应用。

2、近年来研究发现，c-13和c-19所连接的糖基单元的数量及种类对甜菊糖苷的性质有显著影响。例如，莱鲍迪苷a的c-13位置上有一个额外的葡萄糖，使其比甜菊糖更甜更可口。甜叶菊中进一步分离得到的莱鲍迪苷d和莱鲍迪苷m在c-19位置上连接有一个和两个额外的葡萄糖，使其表现出比莱鲍迪苷a更好的甜味品质。因此人们非常关注在这些位置上具有不同的糖基单元的新型甜菊糖苷以挖掘具有更好品质的甜味剂。

3、udp-葡萄糖基转移酶(ugts)是一种天然进化的催化糖基化反应的酶，它们将糖部分从活化的糖供体转移到受体分子上。ugts在甜菊糖苷的合成中已经有了许多的应用。2014年，prakash等人首次报道了一种新型甜菊糖苷衍生物-莱鲍迪苷m2，其是糖基转移酶ugtsl2催化莱鲍迪苷a转化为莱鲍迪苷d的次要产物。但是由于产率较低，产物混杂，分离纯化成本高，限制了对莱鲍迪苷m2的进一步研究。因此，鉴定一种新的具有高催化活性和区域选择性的糖基转移酶催化合成莱鲍迪苷m2是非常有必要的。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明挖掘来自芝麻的糖苷转移酶ugt94d1催化莱鲍迪苷d合成莱鲍迪苷m2，在尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)存在的情况下具有催化莱鲍迪苷d合成莱鲍迪苷m2的活性，为莱鲍迪苷m2的进一步研究提供了可能性。

2、为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

3、本发明的第一个目的是提供一种重组菌，所述重组菌过表达芝麻来源的糖基转移酶ugt94d1。

4、在一种实施方式中，所述糖基转移酶的氨基酸序列的登录号为xp_011076907.1，核苷酸序列的登录号为xm_011078605.1。

5、在一种实施方式中，所述重组菌以原核细胞或真核细胞为宿主细胞。

6、在一种实施方式中，所述原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属(geobacillus)、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属；所述真核细胞为真菌细胞。

7、在一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌为宿主细胞。

8、在一种实施方式中，所述重组菌以pet系列为表达载体。

9、在一种实施方式中，所述重组菌以pet-21b(+)为表达载体。

10、本发明的第二个目的是提供一种组合物，所述组合物为糖基转移酶ugt94d1、所述重组菌或所述重组菌的细胞裂解液中的一种或多种；所述糖基转移酶的氨基酸序列的登录号为xp_011076907.1。

11、在一种实施方式中，所述细胞裂解液为所述重组菌经诱导表达后，裂解细胞获得的上清液。

12、本发明的第三个目的是提供一种催化合成莱鲍迪苷m2的方法，所述方法为以莱鲍迪苷d为底物，利用糖基转移酶ugt94d1、所述重组菌或所述组合物进行催化反应。

13、在一种实施方式中，所述方法以udp-葡萄糖为糖基供体。

14、在一种实施方式中，所述催化体系为0.1～3.0mm reb d，1～10μm糖基转移酶ugt94d1，1～10mm udpg，5～20mm mncl2，20～80mm tris。

15、在一种实施方式中，所述催化反应的条件为在ph为5.5-9.0、30～50℃下反应2～10h。

16、本发明还提供糖基转移酶ugt94d1或上述重组菌或上述组合物或上述方法在制备莱鲍迪苷m2或含有莱鲍迪苷m2的产品中的应用。

17、在一种实施方式中，所述糖基转移酶ugt94d1的氨基酸序列的登录号为xp_011076907.1，核苷酸序列的登录号为xm_011078605.1。

18、有益效果：

19、本发明将编码糖基转移酶ugt94d1的核酸序列用于制备能够催化莱鲍迪苷d生成莱鲍迪苷m2的重组蛋白，制备出的重组蛋白能够以udpg为糖基供体，使莱鲍迪苷d为底物发生糖基化合成莱鲍迪苷m2，且在催化反应过程中无副产物的产生，利于下游纯化，降低生产成本。莱鲍迪苷m2的产率为90％，产量为2.32g/l。

技术特征：

1.一种重组菌，其特征在于，表达来源于芝麻的糖基转移酶ugt94d1，所述糖基转移酶ugt94d1的氨基酸序列的ncbi登录号为xp_011076907.1。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌为宿主细胞。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以pet系列为表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以pet-21b(+)为表达载体。

5.一种组合物，其特征在于，所述组合物为糖基转移酶ugt94d1、权利要求1～4任一所述重组菌或权利要求1～4任一所述重组菌的细胞裂解液中的一种或多种；所述糖基转移酶ugt94d1的氨基酸序列的登录号为xp_011076907.1。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述细胞裂解液为权利要求1～4任一所述重组菌经诱导表达后，裂解细胞获得的上清液。

7.一种催化合成莱鲍迪苷m2的方法，其特征在于，所述方法为以莱鲍迪苷d为底物，利用糖基转移酶ugt94d1、权利要求1～4任一所述重组菌和/或权利要求5或6所述组合物进行催化反应；所述糖基转移酶ugt94d1的氨基酸序列的登录号为xp_011076907.1。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法以udp-葡萄糖为糖基供体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述催化体系为0.1～3.0mm reb d，1～10μm糖基转移酶ugt94d1，1～10mm udp-葡萄糖，5～20mm mncl2，20～80mm tris。

10.糖基转移酶ugt94d1、权利要求1～4任一所述重组菌，或权利要求5或6所述组合物，或权利要求7～9任一所述方法在制备莱鲍迪苷m2或含有莱鲍迪苷m2的产品中的应用；所述糖基转移酶ugt94d1的氨基酸序列的登录号为xp_011076907.1。

技术总结
本发明公开了一种利用糖基转移酶高效生物合成莱鲍迪苷M2的方法，属于生物催化合成技术领域。本发明通过挖掘得到一种具有催化莱鲍迪苷D合成莱鲍迪苷M2的糖基转移酶UGT94D1，为莱鲍迪苷M2的生产提供了一条高效且绿色的新途径。整个催化反应过程中，不产生副产物，利于下游纯化，进一步降低生产成本。

技术研发人员：饶义剑,张艳,杨丽烽,平千
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16