扩增PKD1基因外显子的试剂盒及方法与流程

本申请涉及分子生物学，特别是涉及扩增pkd1基因外显子的试剂盒及方法。

背景技术：

1、多囊肾(polycystic kidney)又名potter(i)综合征、perlmann综合征，先天性肾囊肿瘤病、囊胞肾、双侧肾发育不全综合征等，是一种较常见的遗传性疾病。多囊肾病是继慢性肾小球肾炎、糖尿病肾病和良性肾小动脉硬化导致肾功能衰竭的第四大病因，常累及全身多个系统。主要表现为两侧肾病变进展不对称，大小有差异，至晚期两肾可占满整个腹腔，肾表面布有很多囊肿，使肾形不规则，凹凸不平，最终导致终末期肾病。多囊肾按遗传方式可分为常染色体显性(成人型)多囊肾病(autosomal dominant polycystickidneydisease，adpkd)和常染色体隐性(婴儿型)多囊肾病(autosomalrecessive polycystickidney disease，arpkd)。常染色体隐性多囊肾的发病率约为1/20 000，多见于婴儿，且多在早年死亡，临床较为罕见，该型的发生主要与pkhd1基因突变相关。常染色体显性多囊肾的发生率为1/500-1000人，可在任何年龄发病，多见于成人，临床表现主要有肾脏肿大、血尿、蛋白尿、高血压，晚期可发生肾功能衰竭。多囊肾病的目前治疗主要是积极控制高血压等并发症和防治感染，保护肾功能，延缓尿毒症到来。出现尿毒症时可作透析治疗和肾移植。

2、基因解码研究表明adpkd的致病基因主要由pkd1、pkd2两个基因突变引起，其中约85-90％的患者为pkd1基因突变导致的，约10-15％为pkd2基因突变，pkd1是成人型多囊肾的主要致病基因。通过基因解码技术可以明确病因。随着pkd1基因各种突变类型的不断被发现，基因解码专家将重点关注基因突变类型与囊肿形成的相关性。。

3、pkd1基因编码的蛋白为多囊蛋白1(pc1)，是11次跨膜大分子蛋白，主要表达在肾小管上皮细胞的细胞膜表面，负责将细胞外环境信号传递给胞内信号分子。pkd1基因位于染色体16p13.3区，基因体长达52kb，共有46个外显子，编码区长达12906bp。pkd1基因在16号染色体上存在6个与其同源的假基因，假基因与pkd1基因1-34号外显子序列同源性高达97.7％，大约80％的致病突变发生在此区域。

4、上述pkd1的基因复杂的结构特点和突变特点，给pkd1基因检测带来的巨大的困难。传统的检测pkd1基因的方法各有缺陷，例如常规的pcr或二代测序等方法难以特异性地将pkd1真基因靶向富集并检测，而利用三代测序方法检测pkd1，成本相对较高。由于在pkd1基因扩增实验过程中容易扩增到同源序列，造成扩增失败，检测效率低，目前针对pkd1基因2-34号外显子的pcr扩增通常都是分几个片段来扩增，需要采用多次甚至是不同的pcr反应条件之后才能完成整个基因的扩增，用时较长，效率较低，增加了扩增成本。虽然有研究通过长片段pcr和高通量测序技术检测pkd1基因的方法可以采用相同的扩增反应条件，但在多管长片段pcr方法中，其中任何一个lr-pcr扩增失败，均需要重新制备，这种方法前期处理的工作量大，程序复杂。

技术实现思路

1、基于此，有必要提供一种扩增pkd1基因外显子的试剂盒及方法，用于低成本、高效地扩增pkd1基因外显子，不会扩增到同源序列。

2、本申请提供了一种扩增pkd1基因外显子的试剂盒，包括pcr反应试剂1和pcr反应试剂2中的至少一种；

3、其中，pcr反应试剂1包括：用于扩增pkd1基因2-34号外显子长片段的引物对；用于扩增pkd1基因2-34号外显子长片段的引物对的序列如seq id no:1和seq id no:2所示；

4、pcr反应试剂2包括：用于分别扩增pkd1基因第2号至第34号外显子的扩增引物组合；用于分别扩增pkd1基因第2号至第34号外显子的扩增引物组合的序列分别如seq idno:3-seq id no:56所示。

5、在其中一个实施例中，所述试剂盒包括所述的pcr反应试剂1和pcr反应试剂2。

6、在其中一个实施例中，所述pcr反应试剂1还包括dna聚合酶、pcr缓冲液、dntps以及mg2+中的至少一种。

7、在其中一个实施例中，所述dna聚合酶为kod dna聚合酶。

8、在其中一个实施例中，所述pcr反应试剂2还包括pcr预混液。

9、本申请的第二个方面，提供了一种扩增pkd1基因外显子的方法，包括使用所述的试剂盒进行pcr扩增反应的步骤。

10、在其中的一个实施例中，所述扩增pkd1基因外显子的方法包括如下步骤：

11、获取样本的基因组dna；

12、向所述基因组dna中加入所述试剂盒的pcr反应试剂1进行第一次pcr扩增反应，获得第一次pcr产物；

13、向所述pcr产物中加入所述试剂盒的pcr反应试剂2进行第二次pcr扩增反应，获得第二次pcr产物。

14、在其中的一个实施例中，第一次pcr扩增反应的条件包括：93℃-95℃预变性1min-2min；97℃-99℃变性10s-20s，73℃-75℃延伸14min-16min，4-6个循环；97℃-99℃变性10s-20s，71℃-73℃延伸14min-16min，4-6个循环；97℃-99℃变性10s-20s，69℃-71℃延伸14min-16min，4-6个循环；97℃-99℃变性10s-20s，67℃-69℃延伸14min-16min，22-28个循环；67℃-69℃延伸19min-21min，于3℃-5℃保存。

15、在其中的一个实施例中，对所述第二次pcr产物进行检测的方法为高通量测序。

16、在其中的一个实施例中，第二次pcr扩增反应的条件包括：94℃-96℃预变性85s-95s，93℃-95℃变性35s-45s，55℃-57℃退火35s-45s，71℃-73℃延伸35s-45s，34-36个循环；71℃-73℃延伸4min-6min，于3℃-5℃保存。

17、与传统的技术相比，本申请还包括如下有益效果：

18、本申请提供了一种扩增pkd1基因外显子的试剂盒，包括pcr反应试剂1和pcr反应试剂2中的至少一种。使用本申请的扩增pkd1基因外显子的试剂盒进行扩增时，对pkd1基因第2号至第34号的外显子进行扩增时，设计pcr反应试剂1的pcr引物对避开了pkd1基因同源序列，进行第一次pcr扩增反应的过程中不会扩增到同源序列，避开了同源序列的干扰。本申请再使用pcr反应试剂2的扩增引物组合经过第二次pcr反应体系对第所述一次pcr产物进行第二次扩增，所述扩增引物组合之间互不干扰，得到避免同源序列干扰的pkd1基因测序序列，成功实现了低成本、高效地扩增pkd1的第2号至第34号外显子。

技术特征：

1.一种扩增pkd1基因外显子的试剂盒，其特征在于，包括pcr反应试剂1和pcr反应试剂2中的至少一种；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括所述的pcr反应试剂1和pcr反应试剂2。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应试剂1还包括dna聚合酶、pcr缓冲液、dntps以及mg2+中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述dna聚合酶为kod dna聚合酶。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述pcr反应试剂2还包括pcr预混液。

6.一种扩增pkd1基因外显子的方法，其特征在于，包括使用如权利要求1-5任一项所述的试剂盒进行pcr扩增反应的步骤。

7.根据权利要求6所述的扩增pkd1基因外显子的方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的扩增pkd1基因外显子的方法，其特征在于，第一次pcr扩增反应的条件包括：93℃-95℃预变性1min-2min；97℃-99℃变性10s-20s，73℃-75℃延伸14min-16min，4-6个循环；97℃-99℃变性10s-20s，71℃-73℃延伸14min-16min，4-6个循环；97℃-99℃变性10s-20s，69℃-71℃延伸14min-16min，4-6个循环；97℃-99℃变性10s-20s，67℃-69℃延伸14min-16min，22-28个循环；67℃-69℃延伸19min-21min，于3℃-5℃保存。

9.根据权利要求7所述的扩增pkd1基因外显子的方法，其特征在于，对所述第二次pcr产物进行检测的方法为高通量测序。

10.根据权利要求7所述的扩增pkd1基因外显子的方法，其特征在于，第二次pcr扩增反应的条件包括：94℃-96℃预变性85s-95s，93℃-95℃变性35s-45s，55℃-57℃退火35s-45s，71℃-73℃延伸35s-45s，34-36个循环；71℃-73℃延伸4min-6min，于3℃-5℃保存。

技术总结
本申请提供了一种扩增PKD1基因外显子的试剂盒，包括PCR反应试剂1和PCR反应试剂2中的至少一种；使用本申请的扩增PKD1基因外显子的试剂盒进行检测的方法，避开了PKD1基因同源序列，进行PCR反应的过程中不会扩增到同源序列，避开了同源序列的干扰，成功实现了低成本、高效地扩增PKD1基因外显子。

技术研发人员：李双飞,杜娟,何文斌,林戈,李汶,张前军
受保护的技术使用者：中信湘雅生殖与遗传专科医院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16