用于鉴别威灵仙的引物组及其在威灵仙基原鉴定中的应用的制作方法

本发明属于中药鉴定，涉及威灵仙的鉴定，具体涉及用于鉴别威灵仙的引物组及其在威灵仙基原鉴定中的应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、威灵仙为毛茛科植物威灵仙clematis chinensis osbeck、棉团铁线莲clematishexapetala pall.或东北铁线莲clematis manshuricarupr.的干燥根和根茎。具有祛风除湿、通络止痛、消骨鲠等功效。目前威灵仙市场品种混杂，常规鉴定方法无法有效区分药材真伪。

3、dna条形码技术因其具有较强的通用性以及鉴定结果可重复性的优点，因而被广泛应用于中药材的鉴定中。dna条形码主要是利用基因组中相对较短的dna片段进行药材物种进行鉴别的手段。通过此种方法能建立dna条形码数据库以及鉴定平台，实现药材正品与伪劣品的鉴别。分子鉴定通常的鉴定方法为测序后，采用相似性搜索法和建树法利用相关软件对大量序列进行运算后实现对样本的准确鉴定，由于样本、序列数据库不全面、参比序列经常变化等问题的存在，使得分子鉴定的鉴定指标不够明确。经发明人研究了解，核基因分子标记its2可鉴定威灵仙正品与混伪品，但不能区分三个正品基原。

技术实现思路

1、在大多数被子植物中，母系遗传的叶绿体基因组具有高度保守、非编码区进化速度快等特点，而且叶绿体基因组非编码区中的基因间区具有丰富的遗传变异，叶绿体基因单倍型可直接用于植物遗传多样性检测，发掘多组专属性引物组，能够实现威灵仙的正伪区分，甚至能够实现不同正品威灵仙间的区分。基于上述研究成果，本发明提供了用于鉴别威灵仙的引物组及其在威灵仙基原鉴定中的应用。

2、具体地，本发明的技术方案为：

3、一方面，一种用于鉴别威灵仙的引物组，选自以下至少一对引物组：

4、its2f/its3r引物组，wlx2f/wlx1r引物组，wlxzf/wlxzr引物组；

5、its2f的序列如seq id no.1所示，its3r的序列如seq id no.2所示，wlx2f的序列如seq id no.3，wlx1r的序列如seq id no.4所示的引物组，wlxzf的序列如seq id no.5，wlxzr的序列如seq id no.6所示的引物组。

6、本发明首先使用its2的引物组its2f/its3进行pcr扩增对威灵仙进行鉴定，发现该引物组，能够对威灵仙的正伪进行区分，且能够对少数威灵仙的物种进行鉴别。然后，本发明在ccsa区域设计了wlx2f/wlx1r引物组，该引物组能够区分威灵仙的正伪；在nd5区域设计了wlxzf/wlxzr引物组，该引物组能够区分正品基原；通过wlx2f/wlx1r引物组和wlxzf/wlxzr引物组的结合，能够有效实现对威灵仙的正品基原进行鉴定。

7、另一方面，一种上述用于鉴别威灵仙的引物组在威灵仙基原鉴定中的应用。

8、第三方面，一种用于鉴别威灵仙的检测试剂，包括上述用于鉴别威灵仙的引物组以及溶剂。

9、第四方面，一种用于鉴别威灵仙的检测试剂盒，包括上述用于鉴别威灵仙的引物组、溶剂以及植物基因组dna提取试剂。

10、本发明的有益效果为：

11、本发明对提供的its2f/its3r引物组，通过构建nj树发现其可以区分威灵仙的正伪，通过对8份威灵仙样品的sanger测序表明，有6份可以鉴定为威灵仙正品，剩余两份甚至可以被鉴定到物种。

12、本发明对提供的wlx2f/wlx1r引物组和wlxzf/wlxzr引物组的研究表明，其不易产生二聚体及发夹结构，适合对威灵仙及混伪品进行扩增，并通过wlx2f/wlx1r引物组对威灵仙正伪进行鉴定以及wlxzf/wlxzr引物组对威灵仙正品基原进行鉴定的协同，实现对未知威灵仙的正品基原的鉴定。

技术特征：

1.一种用于鉴别威灵仙的引物组，其特征是，选自以下至少一对引物组：

2.如权利要求1所述的用于鉴别威灵仙的引物组，其特征是，其为wlx2f/wlx1r引物组与wlxzf/wlxzr引物组的组合。

3.一种权利要求1或2所述的用于鉴别威灵仙的引物组在威灵仙基原鉴定中的应用。

4.如权利要求3所述的用于鉴别威灵仙的引物组在威灵仙基原鉴定中的应用，其特征是，采用its2f/its3r引物组待测样本dna进行pcr扩增获得扩增片段，利用扩增片段对待测样本进行威灵仙正伪的区分；对区分后的正品dna进行叶绿体基因组测序、组装和结构解析，将叶绿体全基因组作为超级条形码区分威灵仙的正品基原。

5.如权利要求3所述的用于鉴别威灵仙的引物组在威灵仙基原鉴定中的应用，其特征是，分别采用wlx2f/wlx1r引物组与wlxzf/wlxzr引物组对待测样本dna进行pcr扩增，利用wlx2f/wlx1r引物组pcr扩增的片段对威灵仙的正伪进行区分，用wlxzf/wlxzr引物组pcr扩增的片段对威灵仙的正品基原进行区分。

6.如权利要求3所述的用于鉴别威灵仙的引物组在威灵仙基原鉴定中的应用，其特征是，在不同待测样品的引物组的5'端添加标签序列；

7.一种用于鉴别威灵仙的检测试剂，其特征是，包括权利要求1或2所述的用于鉴别威灵仙的引物组以及溶剂。

8.如权利要求7所述的用于鉴别威灵仙的检测试剂，其特征是，所述溶剂包括巯基乙醇、无水乙醇、氯仿、双蒸水、缓冲液、dna稀释剂中的一种或多种。

9.如权利要求7所述的用于鉴别威灵仙的检测试剂，其特征是，还包括dna聚合酶和/或核酸染料。

10.一种用于鉴别威灵仙的检测试剂盒，其特征是，包括权利要求1或2所述的用于鉴别威灵仙的引物组、溶剂以及植物基因组dna提取试剂。

技术总结
本发明属于中药鉴定技术领域，涉及威灵仙的鉴定，具体涉及用于鉴别威灵仙的引物组及其在威灵仙基原鉴定中的应用。选自以下至少一对引物组：ITS2F/ITS3R引物组，WLX2F/WLX1R引物组，WLXZF/WLXZR引物组；ITS2F的序列如SEQ ID NO.1所示，ITS3R的序列如SEQ ID NO.2所示，WLX2F的序列如SEQ ID NO.3，WLX1R的序列如SEQ ID NO.4所示的引物组，WLXZF的序列如SEQ ID NO.5，WLXZR的序列如SEQ ID NO.6所示的引物组。通过本发明提供的引物组能够对威灵仙的正品基原进行鉴定。

技术研发人员：周书繁,张思聪,王辉,杨玉,苑鹏翀,汪巍
受保护的技术使用者：辽宁上药好护士药业（集团）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16