一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重PCR检测方法与试剂盒

本发明属于疫病检测领域，具体涉及一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重pcr检测方法与试剂盒。

背景技术：

1、牛皮肤癣菌病(dermatophytosis)(亦称铜钱癣、脱毛癣或秃毛癣病)是由皮肤癣菌(dermatophytes)引起的牛浅在性皮肤真菌病，属于临床常发疾病，主要表现为局部的皮肤炎症和病变，对生长发育和育肥增重效果影响较大。引起牛皮肤癣菌病的病原有疣状毛癣菌(trichophyton verrucosum)、须癣毛癣菌(trichophyton mentagrophytes)、犬小孢子菌(microsporum canis)、红色毛癣菌(trichophyton rubrum)、石膏样小孢子菌(microsporum gypseum)等。同时，疣状毛癣菌、犬小孢子菌和须毛癣菌属于重要的人兽共患病原菌，可引起人感染皮肤癣菌病，对公共卫生安全造成了较大威胁。

2、目前，真菌分型鉴定通常采用分离培养及菌落表型特征分析，但是分离培养时间周期长，人为误差大，对于混合真菌样品难以区分，很难对疑似菌进行准确鉴别。近年来，分子生物学检测技术发展迅速，在一定程度上为真菌种属鉴别以及基因分型提供了有力支撑，包括线粒体dna限制性片段长度多态性分析、随机扩增多态性分析以及基于pcr的限制性片段长度多态性分析和随机引物法等，但这些方法存在培养物纯度难以达到要求，操作步骤繁琐等缺点。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种识别疣状毛癣菌的特异性引物对，所述的特异性引物对具体为：正向引物如seq no.1所示，逆向引物如seq no.2所示。

2、本发明还提供了一种识别犬小孢子茵的特异性引物对，所述的特异性引物对具体为：正向引物如seq no.3所示，逆向引物如seq no.4所示。

3、本发明还提供了一种识别须毛癣菌感的特异性引物对，所述的特异性引物对具体为：正向引物如seq no.5所示，逆向引物如seq no.6所示。

4、本发明还提供了一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的试剂盒，包括上述引物对中的至少一种。

5、本发明还提供了一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重pcr检测方法，包括以下步骤：

6、(1)提取待测样品基因组dna；

7、(2)使用seq no.1-seq no.6引物对进行扩增；

8、(3)凝胶电泳检测，于凝胶成像系统下拍照检测，分别存在581bp、1513bp、371bp的dna特异性条带，则确定样品中含有疣状毛癣菌、犬小孢子茵、须毛癣菌。

9、进一步的，步骤(2)中所述的pcr扩增反应程序为：94℃预变性10min；进入循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min10s，30个循环；72℃延伸5min，降温4℃，结束。

10、本发明还提供了一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重pcr检测方法，其特征在于，使用上述试剂盒进行检测。

11、本发明具有以下有益效果：

12、本发明的设计了三对特异性引物，通过优化多重pcr反应条件，建立了一种可同时快速检测这3种真菌的多重pcr，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判读，实用性强，可同时对牛源浅表真菌病原作出快速诊断与鉴别。

技术特征：

1.一种识别疣状毛癣菌的特异性引物对，其特征在于，所述的特异性引物对具体为：正向引物如seq no.1所示，逆向引物如seq no.2所示。

2.一种识别犬小孢子茵的特异性引物对，其特征在于，所述的特异性引物对具体为：正向引物如seq no.3所示，逆向引物如seq no.4所示。

3.一种识别须毛癣菌感的特异性引物对，其特征在于，所述的特异性引物对具体为：正向引物如seq no.5所示，逆向引物如seq no.6所示。

4.一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3所述的引物对中的至少一种。

5.一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的pcr扩增反应程序为：94℃预变性10min；进入循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min10 s，30个循环；72℃延伸5min，降温4℃，结束。

7.一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重pcr检测方法，其特征在于，使用如权利要求4所述的试剂盒进行检测。

技术总结
本发明属于疫病检测领域，具体涉及一种同时检测疣状毛癣菌、犬小孢子茵和须毛癣菌的多重PCR检测方法与试剂盒。本发明的设计三对特异性引物，通过优化多重PCR反应条件，建立了一种可同时快速检测这3种真菌的多重PCR，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判读，实用性强，可同时对牛源浅表真菌病原作出快速诊断与鉴别。

技术研发人员：马晓平,李志国,王娅,左之才,王之盛,古玉,刘真,李昕旎,才冬杰,郭红瑞,苟丽萍
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15