CsKIC基因及其编码的蛋白在调控黄瓜白粉病抗性中的应用

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种与黄瓜白粉病相关的隐性抗病基因——cskic基因的应用。

背景技术：

1、黄瓜是我国主要的蔬菜作物之一，黄瓜白粉病是黄瓜主要的病害之一，每年会造成巨大的损失。黄瓜白粉病作为一种真菌性病害，病菌是专性寄生菌，可随病残体在土壤中越冬。黄瓜白粉病在高温、高湿的环境中易大规模爆发，常使设施栽培的黄瓜感病。黄瓜白粉病的防治目前还主要以化学防治为主，物理防止为主，具有白粉病抗性的种质的选育极为重要。目前选育具有黄瓜白粉病抗性的种质，还主要停留在常规育种上，分子标记辅助育种以及利用基因编辑创制白粉病抗性种质还处在初步阶段。虽然郝俊杰等人(2018)利用ssr标记将白粉病抗性基因定位到的5号染色体15—25mb，但并未报道具体的抗性基因。杨丽等人(2021)通过基因编辑敲除csmlo1基因、csmlo8基因及csmlo11基因，获得了具有白粉病抗性的种质，但mlo基因家族庞大，仅仅敲除一个mlo基因难以获得具有白粉病抗性的黄瓜种质。所以发掘新的白粉病抗性基因对黄瓜白粉病抗性育种具有重大的意义。

2、目前关于kic基因的报道还不多，首次发现是作为一种ca+结合蛋白，与激酶样钙调素结合蛋白(kcbp)相互作用，共同参与调节细胞分裂和毛状体形态发生(vaka s.reddyetal.,2004)。在后续研究的中，有学者发现，kic基因还与钙调素(cam)互作，共同参与毛状体发生(stephanie dobney et al.,2004)。辛静静等人(2020)通过酵母双杂发现，cmkic基因与菊花黑斑病抗性基因cmmlo17相互作用，并通过遗传转化和基因沉默技术验证了cmkic基因在抗菊花黑斑病中作用。有关kic基因的报道，多见于与ca+结合蛋白，参与植物细胞是生长发育以及毛状体的形成，少数报道其与mlo基因互作，具有抗菊花黑斑病作用，但关于kic基因在白粉病上的抗性作用，还未见任何报道。

3、vigs(病毒诱导的基因沉默)技术是一种利用植物病毒作为载体，接种到植物细胞基因组内，导致宿主细胞基因不能正常转录，从而导致基因沉默的技术(mlotshwa s etal.,2008)。vigs的沉默效率和插入片段与靶基因的同源性程度以及病毒载体有很大关系，插入片段一般选取200～350bp，病毒载体应选择适应强、毒性较弱、无传播性的毒株(张丽英，2022)。在过去的几十年中，人们已经开发出了几十种vigs病毒载体，其中报道可用于瓜类的vigs病毒载体却很少，如苹果潜伏球形病毒(alsv)(igarashi a et al.,2009)、烟草环斑病毒(trsv)(zhao f et al.,2016)、烟草摇铃病毒(trv)(liao jj et al.,2019)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(cgmmv)(mei liu et al，2020)等。其中的cgmmv病毒载体是自然条件下感染瓜类植物的重要病原体，可用于许多瓜类作物的基因沉默。本发明就是利用cgmmv载体，通过优化vigs技术，沉默cskic基因，从而获得了具有白粉病抗性的黄瓜植株，在开发新的具有白粉病抗性的黄瓜种质资源方面具有极大应用前景。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供cskic基因及其编码的蛋白在调控黄瓜白粉病抗性中的应用。

2、为实现上述目的，申请人利用vigs基因沉默技术沉默了黄瓜cskic基因，发现沉默cskic基因后增加了黄瓜对白粉病菌的抗病性，从而验证了cskic基因是与黄瓜白粉病相关的隐性抗病基因。

3、所述cskic基因，来源于葫芦科、黄瓜属、黄瓜(cucumis sativus l.)，其核苷酸序列如seq id no：1所示，为cskic基因的开放阅读框(orf)，由378个碱基组成。该基因所编码的蛋白其氨基酸序列如seq id no：2所示，由125个氨基酸残基组成。

4、本发明的第二个目的是提供用于沉默所述cskic基因及其编码的蛋白的vigs载体、含有该vigs载体的工程菌，以及含有该vigs载体的转基因农杆菌在提高黄瓜白粉病抗性中的应用。具体而言，所述vigs载体为在pv190载体的多克隆位点间插入cskic基因沉默序列，尤其是插入seq id no：1所示的cskic基因自5′端第1-300位核苷酸序列。所述工程菌为大肠杆菌dh5α，所述农杆菌为根癌农杆菌gv3101。

5、本发明的第三个目的是提供一种提高黄瓜白粉病抗性的方法，包括以下步骤：

6、1)提取黄瓜rna，反转录成cdna，以cdna为模版，设计pcr引物扩增cskic基因沉默序列；

7、2)纯化回收扩增产物，酶切连接到vigs病毒载体，转化工程菌，获得表达cskic基因沉默序列的vigs载体；

8、3)用vigs载体转化农杆菌，用菌液侵染黄瓜种子，获得cskic基因及其编码蛋白沉默植株。

9、其中，所述cskic基因沉默序列是seq id no：1所示序列自5′端第1-300位核苷酸序列。

10、进一步地，所述pcr引物的正向引物序列如seq id no：3所示，反向引物序列如seqid no：4所示。

11、其中，所述vigs病毒载体为pv190质粒。

12、其中，在用菌液侵染黄瓜种子时，使菌液od值为0.8，超声时间为30s，此时的侵染效率较高。

13、本发明的有益效果是：

14、白粉病严重影响了黄瓜的品质和产量，所造成的危害日益严重，抗病品种培育成为防治白粉病的首选方法。利用基因编辑技术和转基因的方法定点敲除白粉病隐性抗病基因，可以大大地缩短育种年限。在黄瓜中，被报道且被应用的白粉病抗性基因并不多。本发明发掘了cskic基因的一种与黄瓜白粉病抗性有关的新功能，为黄瓜白粉病抗性育种提供了新的选择和靶标。本发明还提供了一种利用cgmmv病毒载体和vigs基因沉默技术提高黄瓜白粉病抗性的方法，为开发新的黄瓜种质资源奠定了基础。接下来，可通过基因编辑技术，敲除cskic基因，来获得能稳定遗传的具有白粉病抗性的黄瓜种质资源。

技术特征：

1.cskic基因及其编码的蛋白在调控黄瓜白粉病抗性中的应用，所述cskic基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。

2.用于沉默权利要求1中所述cskic基因及其编码蛋白的vigs载体在提高黄瓜白粉病抗性中的应用。

3.含有权利要求2中所述vigs载体的转基因农杆菌在提高黄瓜白粉病抗性中的应用。

4.一种提高黄瓜白粉病抗性的方法，其特征在于包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的提高黄瓜白粉病抗性的方法，其特征在于：所述cskic基因沉默序列是seq id no：1所示序列自5′端第1-300位核苷酸序列。

6.如权利要求5所述的提高黄瓜白粉病抗性的方法，其特征在于：所述pcr引物的正向引物序列如seq id no：3所示，反向引物序列如seq id no：4所示。

7.如权利要求4所述的提高黄瓜白粉病抗性的方法，其特征在于：所述vigs病毒载体为pv190质粒。

8.如权利要求4所述的提高黄瓜白粉病抗性的方法，其特征在于：所述侵染的具体条件是，菌液od值为0.8，超声时间为30s。

技术总结
本发明公开了CsKIC基因及其编码的蛋白在调控黄瓜白粉病抗性中的应用，所述CsKIC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。利用VIGS基因沉默技术，发现沉默CsKIC基因后增加了黄瓜对白粉病菌的抗病性，从而验证了CsKIC基因是与黄瓜白粉病相关的隐性抗病基因。本发明发掘了CsKIC基因与黄瓜白粉病抗性有关的新功能，为黄瓜白粉病抗性育种提供了新的选择和靶标，也为开发新的黄瓜种质资源奠定了基础。

技术研发人员：杨丽,蔡如深,马明茹,别之龙,何秋雨,李太彬,陆柳蓉,肖莉,王丹
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16