一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及新抗菌材料合成，具体为一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、具有广谱抗菌性和不易产生耐药性的抗菌肽(amps)已经发展成为极具潜力的抗生素替代物之一。抗菌肽的主要抑菌机制是多肽分子与菌膜静电相互作用，诱发菌膜破损、细胞内容物外泄，从而杀死细菌。

2、由于抗菌肽的链长、净正电荷和蛋白酶水解敏感性，使其传输具有极大的挑战性。因此，设计一种良好的传递系统至关重要，通过将抗菌肽共价连接到传输系统或者非共价封装在传输系统中，能够有效地改善抗菌肽的抗菌活性、稳定性和生物毒性。

3、目前许多材料被发现都可以作为抗菌肽的传输系统，其中常见的用于药物递送的材料有蛋白质、聚合物、脂质类、胶束等，以牛血清白蛋白bsa为基础的传输系统因其具有生物降解性、非免疫原性、生物相容性和较长的半衰期而受到越来越多的关注。牛血清白蛋白bsa是由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。

4、本发明引用参考文献如下：

5、哈尔滨工业大学在2019年刊出的郝玉秀的硕士学位论文《含羟基poss的合成及其改性硅树脂耐热性的研究》公开了三硅醇苯基poss的化学结构和合成方法；

6、河南工业大学在2021年刊出的贺松林的硕士学位论文《抗菌肽samp-a4及衍生物设计合成及成药性初步研究》公开了samp-a4的化学结构、合成方法及肽序列。

技术实现思路

1、本发明设计合成了一种新型的芳醛基吡啶二硫基偶联试剂，所述偶联试剂上不仅能够修饰多重抗菌肽，而且能够作为桥梁将抗菌肽连接到载体蛋白上，提升抗菌肽的抗菌活性，并且还能够在抗菌药物研发中应用，其技术方案具体如下：

2、第一方面，本发明提供一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物，所述抗菌多肽修饰的蛋白衍生物为：抗菌肽-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白偶联产物；

3、其中，抗菌肽包含有伯氨基官能团；

4、载体蛋白包含有自由巯基官能团；

5、利用芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的活化巯基官能团与载体蛋白的自由巯基官能团发生巯基交换反应，形成非对称的二硫键，然后通过芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的芳醛基官能团与抗菌肽的伯氨基官能团发生席夫碱反应，形成动态的亚胺键，制备得到抗菌肽-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白偶联产物。

6、优选的，所述芳醛基吡啶二硫基偶联试剂包括芳醛基吡啶二硫基偶联试剂ⅰ或/和芳醛基吡啶二硫基偶联试剂ⅱ。

7、优选的，所述芳醛基吡啶二硫基偶联试剂ⅰ的制备方法为：

8、步骤s1，通过2,2'-二硫二吡啶与巯丙基三甲氧基硅烷的巯基官能团发生巯基活化交换反应，制备三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体；

9、步骤s2，使用维尔斯迈尔-哈克(vilsmeier-haack)反应，以n,n-二甲基甲酰胺dmf为甲酰化试剂、乙腈ch3cn为溶剂，在三氯氧磷pocl3催化剂作用下，对甲氧基二甲基苯硅烷进行甲酰化反应，制备得到芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体；

10、步骤s3，以对苯二酚为阻聚剂、氯化亚锡为助阻聚剂，利用水解缩合法，通过三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体与芳醛基甲氧基二甲基硅烷单体直接发生水解缩合反应，制备得到芳醛基吡啶二硫基偶联试剂ⅰ。

11、优选的，所述芳醛基吡啶二硫基偶联试剂ⅱ的制备方法为：

12、步骤s1，使用维尔斯迈尔-哈克(vilsmeier-haack)反应，以n,n-二甲基甲酰胺dmf为甲酰化试剂、乙腈ch3cn为溶剂，在三氯氧磷pocl3催化剂作用下，对三硅醇苯基poss进行甲酰化反应，制备得到芳醛基三硅醇poss单体；

13、步骤s2，使用顶角盖帽法，以芳醛基三硅醇poss单体为原料、甲苯为溶剂、四乙基氢氧化铵为催化剂，把三甲氧基吡啶二硫基硅烷单体作为盖帽试剂，制备得到芳醛基吡啶二硫基偶联试剂ⅱ。

14、另一方面，本发明提供一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物的制备方法，所述制备步骤如下：

15、步骤s1，利用过滤器把溶解载体蛋白的缓冲液转换为磷酸盐缓冲液，调节蛋白浓度；

16、步骤s2，利用磷酸盐缓冲液溶解芳醛基吡啶二硫基偶联试剂，溶解之后加入到步骤s1的载体蛋白液中；

17、步骤s3，缓摇反应之后转换缓冲液到磷酸盐缓冲液中，调节芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白浓度；

18、步骤s4，利用磷酸盐缓冲液溶解抗菌肽，并配制抗菌肽溶液；

19、步骤s5，向芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白中加入过量的抗菌肽溶液，在溶液上覆盖氮气，缓摇反应，之后对溶液充分透析以除去未反应的抗菌肽，得到抗菌肽-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白偶联产物。

20、优选的，所述步骤s1：磷酸盐缓冲液的ph为4.0~5.0；

21、优选的，所述步骤s2：磷酸盐缓冲液的ph为4.0~5.0；

22、优选的，所述步骤s3：磷酸盐缓冲液的ph为8.0~10.0、浓度为0.5m；

23、优选的，所述步骤s4：磷酸盐缓冲液的ph为8.0~10.0、浓度为0.5m。

24、优选的，所述载体蛋白选择使用牛血清白蛋白bsa、重组人血清白蛋白hsa中的一种或者两种组合。

25、优选的，所述抗菌肽选择使用抗菌肽(samp-a4)。

26、第三方面，本发明提供一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物，其能够在抗菌药物研发中应用。

27、与现有技术相比，本发明具备以下有益的技术效果：

28、本发明：首先合成芳醛基吡啶二硫基偶联试剂：芳醛基吡啶二硫基偶联试剂ⅰ、芳醛基吡啶二硫基偶联试剂ⅱ；

29、其次使用芳醛基吡啶二硫基偶联试剂把含有自由巯基官能团的载体蛋白与含有伯氨基官能团的抗菌肽连接，制备得到抗菌肽-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白偶联产物，其上能够修饰多重抗菌肽，增强多重抗菌肽分子与细菌细胞间的选择性和结合力，提升抗菌肽的抑菌效率；

30、本发明提供了一种研发抗菌药物的新方法。

技术特征：

1.一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物，其特征在于，所述抗菌多肽修饰的蛋白衍生物为：抗菌肽-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白偶联产物；

2.根据权利要求1所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物，其特征在于，所述芳醛基吡啶二硫基偶联试剂包括芳醛基吡啶二硫基偶联试剂ⅰ或/和芳醛基吡啶二硫基偶联试剂ⅱ。

3.根据权利要求1-2任一项所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：利用芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的活化巯基官能团与载体蛋白的自由巯基官能团发生巯基交换反应，形成非对称的二硫键，然后通过芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的芳醛基官能团与抗菌肽的伯氨基官能团发生席夫碱反应，形成动态的亚胺键，制备得到抗菌肽-芳醛基吡啶二硫基偶联试剂-载体蛋白偶联产物。

4.根据权利要求3所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述芳醛基吡啶二硫基偶联试剂ⅰ的制备方法为：

5.根据权利要求3所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述芳醛基吡啶二硫基偶联试剂ⅱ的制备方法为：

6.根据权利要求3所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备步骤如下：

7.根据权利要求6所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤s1：磷酸盐缓冲液的ph为4.0~5.0；

8.根据权利要求6所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤s3：磷酸盐缓冲液的ph为8.0~10.0、浓度为0.5m；

9.根据权利要求6所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物的制备方法，其特征在于，所述载体蛋白选择使用牛血清白蛋白bsa、重组人血清白蛋白hsa中的一种或者两种组合；

10.根据权利要求1-2任一项所述的抗菌多肽修饰的蛋白衍生物在制备抗菌药物研发中的应用。

技术总结
本发明涉及新抗菌材料合成技术领域，具体为一种抗菌多肽修饰的蛋白衍生物及其制备方法和应用，所述抗菌多肽修饰的蛋白衍生物为：抗菌肽‑芳醛基吡啶二硫基偶联试剂‑载体蛋白偶联产物；抗菌肽包含有伯氨基官能团；载体蛋白包含有自由巯基官能团；利用芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的活化巯基官能团与载体蛋白的自由巯基官能团发生巯基交换反应，形成非对称的二硫键，然后通过芳醛基吡啶二硫基偶联试剂的芳醛基官能团与抗菌肽的伯氨基官能团发生席夫碱反应，形成动态的亚胺键，制备得到抗菌肽‑芳醛基吡啶二硫基偶联试剂‑载体蛋白偶联产物，其通过修饰多重抗菌肽，增强多重抗菌肽分子与细菌细胞间的选择性和结合力，提升抗菌肽的抗菌活性。

技术研发人员：何伶杰,夏彬
受保护的技术使用者：南京杰肽生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15