一对敲除猴SLC35B2基因的sgRNA及应用

本发明涉及动物基因工程，具体涉及一对敲除猴slc35b2基因的sgrna及在制备抗猪伪狂犬病毒中的应用。

背景技术：

0、技术背景

1、随着位点特异性核酸酶的发展，crispr/cas9因其简单、高效、低成本、多功能性和特异性开始在基因组编辑中广泛应用，对生物学研究产生革命性的影响。crispr/cas9作为基因编辑工具，它介导的基因组工程已被广泛高效地应用于各种物种中。通过利用crispr/cas9可以实现精确的条件性基因敲除、基因敲入、基因替换、点突变等，为基因的功能研究提供了一个有吸引力的策略。

2、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)自然条件下可以感染多种哺乳动物并导致引发猪伪狂犬病。猪伪狂犬病发病临床上主要表现为发热和神经症状，可以引发妊娠期母猪流产死胎、仔猪致死、育肥猪滞长以及种猪不育。目前亦出现了超强毒株的变异，导致全国大部分省市都有发病，给生猪养殖业带来巨大危害，造成严重的经济损失。

3、slc35b2基因主要参与生物体内硫酸乙酰肝素(hs)途径的调节。hs会支持病毒与宿主细胞结合、内化和去包被。slc35b2在调节包括硫酸乙酰肝素硫酸化和蛋白酪氨酸硫酸化在内的整体硫酸化过程中均发挥左右，这对于病毒的进入是至关重要的。

技术实现思路

1、基于slc35b2基因的重要调节作用与已有的工作基础和技术平台，本发明利用crispr/cas9介导的基因敲除技术，以vero细胞为研究对象，探究slc35b2对prv感染的影响，应用于预防和控制prv以及抗病靶点研究等方面，并且可以在其它研究领域提供科研价值及应用价值。

2、本发明一对敲除猴slc35b2基因的sgrna序列，靶向slc35b2基因的第三、四外显子区域，靶序列为atagctacgggtcatcactc和ggtgaaagcttgt gtctttg，具有较高的靶向效率和敲除效率。所述敲除基于crispr/cas9系统进行，所述sgrna序列包括sgrna1和sgrna2，敲除后slc35b2基因表达被抑制；所述sgrna1的dna序列的正义链如seq id no：1，其对应互补链的dna序列如seq id no：2；所述sgrna2的dna序列的正义链如seq id no：3，其对应互补链的dna序列如seq id no：4。

3、本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒中包含上述一对敲除猴slc35b2基因的sgrna序列，所述试剂盒用于：

4、一、特异性识别猴slc35b2基因；

5、二、敲除猴slc35b2基因。

6、本发明还提供一种生物材料，所述生物材料包括上述的特异性靶向敲除猴slc35b2基因的两条sgrna，所述生物材料为载体或转基因细胞。

7、本发明还提供一种敲除载体，可使猴slc35b2基因表达被抑制，由上述sg rna 1和sgrna 2的双链dna与载体连接得到。所述载体为px459载体。所述crispr-cas9系统的敲除载体的制备方法，其包括：合成所述sgrna1的dn a序列的正义链如seq id no：1，其对应互补链的dna序列如seq id no：2；所述sgrna2的dna序列的正义链如seq id no：3，其对应互补链的dn a序列如seq id no：4，再将单链dna序列经过退火合成双链dna后，连接到px459载体骨架的bbs i酶切位点形成完整的靶向质粒。

8、本发明还提供上述sgrna序列在制备slc35b2基因表达被抑制的细胞系中的应用；所述细胞系为vero细胞系。所述vero细胞系的构建方法：将含有所述特异性靶向slc35b2基因的sgrna的crispr/cas9基因敲除载体导入细胞，敲除slc35b2基因。将所述crispr/cas9基因敲除载体导入细胞可通过电转染等常规生物学方法实现。

9、本发明还提供一种抗prv能力的基因敲除猴模型的制备方法，其为利用上述crispr/cas9基因敲除载体实现猴slc35b2基因的敲除。

10、本发明还提供上述sgrna序列在制备以猴slc35b2基因为靶点的预防和控制prv药物中的应用。

11、有益效果如下：

12、本发明以一对能特异识别猴slc35b2基因的sgrna为前提，利用crispr/cas9技术，成功地在vero细胞系中敲除了slc35b2基因。又经过试验验证：本发明的slc35b2基因敲除细胞系能够在一定程度上抑制prv在细胞中的增殖，对于抗猪源病毒药物的研究及抗病毒靶点的筛选具有重要意义。本发明提供的slc35b2基因的敲除方法具有很强的实用性，为slc35b2基因的功能研究及其应用提供了有效方法和基础。

技术特征：

1.一对敲除猴slc35b2基因的sgrna，其特征在于：

2.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包含如权利要求1所述一对敲除猴slc35b2基因的sgrna，所述试剂盒用于：

3.一种敲除载体，其特征在于：可使slc35b2基因表达被抑制，由如权利要求1所述sgrna 1和sgrna 2的双链dna与载体连接得到。

4.如权利要求3所述敲除载体，其特征在于：所述载体为px459载体。

5.如权利要求1所述一对敲除猴slc35b2基因的sgrna在制备slc35b2基因表达被抑制的细胞系中的应用。

6.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述细胞系为vero细胞系。

7.如权利要求1所述一对敲除猴slc35b2基因的sgrna在制备slc35b2基因表达被显著抑制的猴模型中的应用。

8.如权利要求1所述一对敲除猴slc35b2基因的sgrna在制备以slc35b2基因为靶点的预防和控制prv药物中的应用。

技术总结
本发明提供一对敲除猴SLC35B2基因的sgRNA及应用，靶向SLC35B2基因的第三、四外显子区域，具有较高的靶向效率和敲除效率，敲除基于CRISPR/Cas9系统进行，sgRNA序列包括sgRNA1和sgRNA2，敲除后SLC35B2基因表达被抑制；sgRNA1的DNA序列的正义链如SEQ ID NO：1，其对应互补链的DNA序列如SEQ ID NO：2；sgRNA2的DNA序列的正义链如SEQ ID NO：3，其对应互补链的DNA序列如SEQ ID NO：4，SLC35B2基因敲除细胞系能够在一定程度上抑制PRV在细胞中的增殖，对于抗PRV药物靶点筛选研究具有重要意义。

技术研发人员：谢子聪,欧阳红生,逄大欣,王希,周健
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/22