一种基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针及其制备方法和应用

本发明属于小分子荧光探针领域，具体涉及一种基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、半胱氨酸是生物体内一种重要的内源性硫醇，被认为是维持氧化还原稳态的重要生物分子。细胞内半胱氨酸的浓度在30-200μm之间变化，总血浆中的浓度约为250μm。正常情况下，生命系统中半胱氨酸的产生、消耗，聚集，消除都处于动态平衡状态，其浓度的波动与多种疾病有关，包括阿尔兹海默症、帕金森等神经退行性疾病、心血管疾病、肝损伤、癫痫等。因此，有必要监测和量化生物系统中半胱氨酸的浓度水平以评估其分布和代谢特征，这对了解半胱氨酸在化学和生物学领域的作用至关重要。

2、近年来，高效液相色谱法、质谱法、毛细管区带电泳等方法被广泛应用于半胱氨酸的测定，尤其是荧光法检测半胱氨酸取得了快速发展。更重要的是，半胱氨酸响应型荧光探针具有强大的分析和鉴别能力，提高了检测的灵敏度和速度。此外，荧光探针由于其高时空分辨率和灵敏度，特别是在体内分析方面，已被认为是测量半胱氨酸的有力工具。到目前为止，大多数响应半胱氨酸的荧光探针都是基于半胱氨酸的氧化还原性和亲核性。采用的荧光传感机制主要有丙烯酸酯环化，醛环化，迈克尔加成反应等。目前报道的响应半胱氨酸的荧光母体主要集中在香豆素、喹啉、萘酰亚胺、荧光素和bodipy。因此，利用新型荧光母体检测半胱氨酸以提高生物系统的成像深度和信噪比，仍需不断努力。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针及其制备方法，该双光子荧光探针的反应速度快、特异性强、灵敏性好并具有优异的双光子性能。

2、本发明的另一目的还在于提供所述基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针在定量检测半胱氨酸中的应用，其用于定量检测半胱氨酸的浓度时，灵敏度高，检测限低至232nm。

3、本发明的另一目的还在于提供所述基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针在非疾病诊断和治疗目的的细胞荧光成像中的应用，可实现对hela细胞内源性和外源性半胱氨酸的荧光成像，以及对hela细胞外源性半胱氨酸的双光子荧光成像。

4、为实现上述目的本发明采取的技术方案如下：

5、本发明提供了一种基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针，其特征在于，所述双光子荧光探针的结构式为：

6、

7、本发明还提供了所述基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针的制备方法包括以下步骤：

8、(1)将4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑、4-羟基苯硼酸频哪醇酯、四丁基溴化铵、四(三苯基膦)钯加入到甲苯和乙醇混合溶液中，然后加入碳酸钾溶液，在惰性气体的保护下，75～85℃搅拌反应20～24小时，然后将反应液萃取、浓缩，纯化、干燥，得到单羟基取代的2,1,3-苯并噻二唑化合物btd-br，所述btd-br的结构式为：

9、(2)以btd-br替换步骤(1)中的4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑，重复步骤(1)合成双羟基取代的2,1,3-苯并噻二唑荧光母体btd-oh，所述btd-oh的结构式为：

10、

11、(3)将btd-oh与4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑(nbd-cl)溶解于无水乙腈中，然后加入碳酸钾，室温搅拌6～8h，反应结束后经离心、洗涤、干燥，即可得到所述基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针f-btd。步骤(1)中，4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑、4-羟基苯硼酸频哪醇、四丁基溴化铵、四(三苯基膦)钯的物质的量之比为1：1.2～1.5：0.05～0.06：0.01～0.02。

12、步骤(1)中，甲苯和乙醇的体积比为3：2；4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑在甲苯和乙醇混合溶液中的浓度为0.1～0.2mol/l。

13、步骤(1)中，碳酸钾溶液的浓度为1.5～2.5mol/l；碳酸钾溶液与甲苯和乙醇混合溶液的体积比为1:5。

14、步骤(1)中，所述纯化的方法为：以乙酸乙酯：石油醚＝1：3～5为洗脱剂，经硅胶柱纯化收集产物并浓缩。

15、步骤(2)中，btd-br、4-羟基苯硼酸频哪醇、四丁基溴化铵、四(三苯基膦)钯的物质的量之比为1：1.2～1.5：0.05～0.06：0.01～0.02。

16、步骤(2)中，粗产物纯化的方法为：以乙酸乙酯：石油醚＝1：2～4为洗脱剂，经硅胶柱纯化收集产物并浓缩。

17、步骤(3)中，btd-oh、nbd-cl、碳酸钾的物质的量之比为1：2.2～2.5：3～5。

18、步骤(3)中，nbd-cl在乙腈溶液中的浓度为0.01～0.02mol/l。

19、本发明还提供了所述基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针在定量检测半胱氨酸中的应用。

20、本发明还提供了所述基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针在非疾病诊断和治疗目的的细胞荧光成像中的应用。

21、本发明采用三步合成法，简单方便地合成了基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的荧光探针f-btd，其结构中，双羟基取代2,1,3-苯并噻二唑为荧光团，硝基-2,1,3-苯并噁二唑(nbd-cl)为识别基团，两者之间通过醚键联接。结构中的识别基团nbd具有很强的吸电子能力，因此探针分子f-btd荧光很弱。但当加入半胱氨酸后，由于半胱氨酸强的还原能力导致醚键断裂，释放出荧光母体，体系荧光增强。

22、体外实验结果表明f-btd能够在2min内响应半胱氨酸并且具有双光子性能，双光子吸收截面为93gm。其次，f-btd具有良好的特异性，该探针对生物系统中的金属离子、氨基酸、其他生物硫醇和还原性物质均无明显的响应。细胞成像实验结果表明f-btd能够对hela细胞内源性和外源性的半胱氨酸进行荧光成像。更重要的是，它能够对hela细胞外源性半胱氨酸进行双光子荧光成像。因此，f-btd在半胱氨酸相关的研究和监测中具有良好的应用前景。

23、与现有技术相比，本发明提供的基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针f-btd的反应速度快、特异性强，灵敏性好并具有优异的双光子性能。

技术特征：

1.一种基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针，其特征在于，所述双光子荧光探针的结构式为：

2.如权利要求1所述的基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑、4-羟基苯硼酸频哪醇、四丁基溴化铵、四(三苯基膦)钯的物质的量之比为1：1.2～1.5：0.05～0.06：0.01～0.02。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，甲苯和乙醇的体积比为3：2；4,7-二溴-2,1,3-苯并噻二唑在甲苯和乙醇混合溶液中的浓度为0.1～0.2mol/l。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，碳酸钾溶液的浓度为1.5～2.5mol/l；碳酸钾溶液与甲苯和乙醇混合溶液的体积比为1:5。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述纯化的方法为：以乙酸乙酯：石油醚＝1：3～5为洗脱剂，经硅胶柱纯化收集产物并浓缩。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，btd-oh、nbd-cl、碳酸钾的物质的量之比为1：2.2～2.5：3～5。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，nbd-cl在乙腈溶液中的浓度为0.01～0.02mol/l。

9.如权利要求1所述的基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针在定量检测半胱氨酸中的应用。

10.如权利要求1所述的基于2,1,3-苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针在非疾病诊断和治疗目的的细胞荧光成像中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于2,1,3‑苯并噻二唑快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针及其制备方法和应用，本发明通过三步合成了基于2,1,3‑苯并噻二唑的快速响应半胱氨酸的双光子荧光探针F‑BTD，其具有双光子性能，可用于快速、灵敏地定量检测半胱氨酸，并能对HeLa细胞外源性和内源性半胱氨酸进行荧光成像，对细胞内外源性半胱氨酸双光子荧光成像的能力。

技术研发人员：高峰,张自伟
受保护的技术使用者：安徽师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15