一种突变的V型CRISPR酶及其应用的制作方法

本申请属于生物，具体地，涉及一种突变的v型crispr酶及其应用。

背景技术：

1、v型crispr-cas系统也被称为cas12家族，它和其它crispr-cas系统区别之处在于它是由单ruvc活性中心驱动的一个rna介导的单效应子核酶。随着越来越多的cas12被挖掘和识别出来，该家族已存在v-a，v-b，v-c，v-d，v-e，v-f，v-g，v-h，v-i，v-j，v-k等多个类别。

2、其中cas12a和cas12b由于其优异的反应性能，被用于多个与扩增技术联合的核酸检测技术及临床检测产品中。

3、在继往的报道中，cas12a或cas12b都是具备rna介导的顺式dnase活性和反式dnase的活性，以及应运而生的检测应用；在某些报道中虽有提及cas12a或cas12b具备rna介导的反式rnase的活性，可以以比dna底物1/10的效率进行rna底物的切割，但其对dna底物的优先选择性，限制了在核酸扩增体系中其进一步的应用。这种有限的一个数量级的区分度，rna探针作为另外一种报告底物进行检测的可能性。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本申请提供一种突变的v型crispr酶及其应用。

2、具体来说，本申请涉及如下方面：

3、1.一种工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其包含如下突变：

4、将参比cas12蛋白中ruvc和/或nuc活性中心识别切割dna底物的限制去除，

5、优选地，参比cas12蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。

6、2.根据项1所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中将参比cas12蛋白中ruvc和/或nuc活性中心识别切割dna底物的限制去除通过以下方式实现：

7、将参比cas12蛋白中的守门氨基酸的α螺旋上下游的手指替换为锌指结构域。

8、3.根据项1或2所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中将参比cas12蛋白中ruvc和/或nuc活性中心识别切割dna底物的限制去除是针对915-945位中的部分或全部区域进行结构域的替换，其中氨基酸位置编号如seq id no:1所定义。

9、4.根据项2所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中所述锌指结构域具有1至2个锌结合位点，所述锌结合位点选自[cxxxxc]、[cxxxxh]、[cxxxc]、[hxxxh]、[cxxc]、[cxxh]中的一种，其中x表示任意天然氨基酸。

10、5.根据项4所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中所述锌指结构域为cas12g或hiv-1核壳体蛋白7(ncp7)的锌指结构域。

11、6.根据项5所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中参比cas12蛋白的919-944位替换为seq id no:4所示的氨基酸序列，其中氨基酸位置编号如seq id no:1所定义。

12、7.根据项5所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中参比cas12蛋白的919-944位替换为seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸位置编号如seq id no:1所定义。

13、8.根据项1所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中参比cas12蛋白的919-944位替换为seq id no:8所示的氨基酸序列，其中氨基酸位置编号如seq id no:1所定义。

14、9.根据项1所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中参比cas12蛋白的916-944位替换为seq id no:11所示的氨基酸序列，其中氨基酸位置编号如seq id no:1所定义。

15、10.一种工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其包含基于参比cas12蛋白的如下突变中的一种：

16、参比cas12蛋白的919-944位替换为seq id no:4所示的氨基酸序列；

17、参比cas12蛋白的919-944位替换为seq id no:6所示的氨基酸序列；

18、参比cas12蛋白的919-944位替换为seq id no:8所示的氨基酸序列；

19、参比cas12蛋白的916-944位替换为seq id no:11所示的氨基酸序列；

20、其中参比cas12蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。

21、11.一种工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其序列为如seq id no:5、7、9或12中任一项所示的氨基酸序列。

22、12.一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，所述体系包含：

23、项1-11中任一项所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物；

24、向导rna，所述向导rna引导cas12蛋白或其功能衍生物特异性结合于靶标核酸分子；和核酸探针。

25、13.根据项12所述的检测体系，其中所述核酸探针为rna探针。

26、14.一种检测样品中靶标核酸分子的方法，包括：

27、使样品与项1-11中任一项所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物、向导rna和靶标核酸分子接触；以及

28、测量通过所述工程化的cas12蛋白或其功能衍生物切割核酸探针而产生的可检测信号，从而检测所述靶标核酸分子。

29、15.根据项14所述的方法，其中核酸探针为rna探针。

30、16.一种选择性检测靶标核酸分子的检测体系，所述体系包含：

31、两种以上对于rna和dna的切割特异性有显著性差异的cas12蛋白或其功能衍生物；

32、向导rna，所述向导rna引导cas12蛋白或其功能衍生物特异性结合于靶标核酸分子；和

33、核酸探针。

34、17.根据项16所述的检测体系，其中至少一种所述cas12蛋白或其功能衍生物为项1-11中任一项所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物。

35、18.根据项17所述的检测体系，其中所述核酸探针为dna探针或rna探针。

36、本申请通过蛋白突变理性突变技术，把cas12b中ruvc识别切割dna底物的限制去除，可以特异性的识别dna底物或特异性的识别rna底物，在实际应用中解决dna/rna底物识别的区分度不足的问题。

37、本申请的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物提高cas12反式切割活性打开后对rna底物反应效率，提高cas12使用rna探针的报告效率。

技术特征：

1.一种工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其包含如下突变：

2.根据权利要求1所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中将参比cas12蛋白中ruvc和/或nuc活性中心识别切割dna底物的限制去除通过如下方式实现：

3.根据权利要求1或2所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中将参比cas12蛋白中ruvc和/或nuc活性中心识别切割dna底物的限制去除是针对915-945位中的部分或全部区域进行结构域的替换，其中氨基酸位置编号如seq id no:1所定义。

4.根据权利要求2所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中所述锌指结构域具有1至2个锌结合位点，所述锌结合位点选自[cxxxxc]、[cxxxxh]、[cxxxc]、[hxxxh]、[cxxc]、[cxxh]中的一种，其中x表示任意天然氨基酸。

5.根据权利要求4所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中所述锌指结构域为cas12g或hiv-1核壳体蛋白7(ncp7)的锌指结构域。

6.根据权利要求5所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中参比cas12蛋白的919-944位替换为seq id no:4所示的氨基酸序列，其中氨基酸位置编号如seq id no:1所定义。

7.根据权利要求5所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中参比cas12蛋白的919-944位替换为seq id no:6所示的氨基酸序列，其中氨基酸位置编号如seq id no:1所定义。

8.根据权利要求1所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中参比cas12蛋白的919-944位替换为seq id no:8所示的氨基酸序列，其中氨基酸位置编号如seq id no:1所定义。

9.根据权利要求1所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其中参比cas12蛋白的916-944位替换为seq id no:11所示的氨基酸序列，其中氨基酸位置编号如seq id no:1所定义。

10.一种工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其包含基于参比cas12蛋白的如下突变中的一种：

11.一种工程化的cas12蛋白或其功能衍生物，其序列为如seq id no:5、7、9或12中任一项所示的氨基酸序列。

12.一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，所述体系包含：

13.根据权利要求12所述的检测体系，其中所述核酸探针为rna探针。

14.一种检测样品中靶标核酸分子的方法，包括：

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述核酸探针为rna探针。

16.一种选择性检测靶标核酸分子的检测体系，所述体系包含：

17.根据权利要求16所述的检测体系，其中至少一种所述cas12蛋白或其功能衍生物为权利要求1-11中任一项所述的工程化的cas12蛋白或其功能衍生物。

18.根据权利要求17所述的检测体系，其中所述核酸探针为dna探针或rna探针。

技术总结
本申请提供一种突变的V型CRISPR酶及其应用。本申请通过蛋白突变理性突变技术，把Cas12a或Cas12b中RuvC识别切割DNA底物的限制去除，使其能够高效率地识别和切割RNA底物，在实际应用中解决RNA底物识别的效率不足的问题。提高Cas12反式切割活性打开后对RNA底物反应效率，提高Cas12使用RNA探针的报告效率。

技术研发人员：潘伟业,孙阳,陈重建,朱鹏宇,尤胜浩
受保护的技术使用者：北京迅识科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4