一种与水芹萜品油烯合成相关的OjTPS3基因序列及其应用

本发明属于植物基因，具体涉及到与一种水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列及其应用。

背景技术：

1、水芹[oenanthe javanica(bl.)dc.]，俗名水英、野芹菜等，是伞形科水芹属多年生水生草本植物。水芹是一种营养丰富的特色水生蔬菜，含有丰富的维生素、类黄酮和矿物质，也是一种对人体健康有益的传统中药，具有清热、降低血压、血糖和促进消化等功效。水芹作为一种特色水生蔬菜，具有独特的风味，研究表明水芹的风味主要与萜类物质的合成和积累相关。萜品油烯是一种单萜类化合物，具有重要的工业及药用功效，因其具有香味也广泛用作调味品。另外，植物中萜品油烯在果实特有香气及花香的形成中也发挥着重要的作用。

2、萜品油烯属于萜类化合物，植物中萜类化合物是由通用前体异戊烯二磷酸(ipp)或二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)产生的，这两个5碳前体是在甲羟戊酸(mva)途径和甲基赤藓糖醇-4-磷酸脂(mep)途径中生成。ipp和dmapp可转化为不同的萜类化合物合成前体物质，包括香叶基焦磷酸(gpp)、香叶基香叶基焦磷酸(ggpp)和法尼基焦磷酸(fpp)。tps家族的酶在萜类化合物的最后生物合成步骤中发挥重要作用，tps家族基因种类繁多，单萜合酶催化gpp反应生成单萜烯(c10)，倍半萜合酶催化fpp生成倍半萜烯(c15)，二萜合酶催化ggpp生成二萜烯(c20)，上述萜类产物又可在多种修饰酶的作用下发生甲基化、过氧化、羟基化和糖基化等反应最终形成多种多样复杂的萜类化合物，植物中催化萜品油烯合成的主要是单萜合成酶。萜品油烯在水芹独特风味形成中具有重要的作用，鉴定水芹中负责合成萜品油烯的tps家族基因，对明确水芹风味形成的分子机理以及通过基因工程、代谢工程等进行萜品油烯的体外合成等研究具有重要的意义。

技术实现思路

1、本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

2、鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

3、因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种与水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列。

4、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种与水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列，其包括：ojtps3基因序列如seq id no.1所示。

5、本发明的另一个目的是提供一种过表达权利要求1所述的ojtps3基因序在提高水芹或原核微生物表达含量中的应用。

6、为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：过表达权利要求1所述的ojtps3基因序在提高水芹或原核微生物表达含量中的应用。

7、作为本发明所述过表达权利要求1所述的过表达ojtps3基因序列的应用的一种优选方案，其中：克隆权利要求1所述的ojtps3基因，构建ojtps3基因的过表达载体，转化到原核生物中，确定萜品油烯表达量提高的微生物并同时获得表达的萜品油烯。

8、作为本发明所述过表达权利要求1所述的过表达ojtps3基因序列的应用的一种优选方案，其中：原核生物为大肠杆菌。

9、作为本发明所述过表达权利要求1所述的过表达ojtps3基因序列的应用的一种优选方案，其中：

10、获得cdna：提取来源植物的总rna，将总rna反转成cdna；

11、ojtps3基因的克隆：设计克隆引物，以反转得到的cdna为模板利用pcr进行克隆，连接到载体中；

12、序列分析：测序比较水芹ojtps3基因的序列，分析比对并且绘制进化树；

13、载体构建及蛋白纯化：根据ojtps3基因以及使用的载体的序列，设计引物，将ojtps3基因通过重组技术连接到载体上；

14、原核表达及蛋白纯化：将含ojtps3基因的重组质粒转化到大肠杆菌中，挑选转化完成的菌落在选择性培养基中，培养，培养过程中添加异丙基-β-d-硫代半乳糖苷进行诱导，培养完成后离心收集菌液，分离纯化后过柱洗脱纯化蛋白，鉴定蛋白；

15、纯化ojtps3蛋白酶活检测：使用固相微萃取技术-气相色谱-质谱联用技术对于ojtps3蛋白进行体外酶活性检测。

16、作为本发明所述过表达权利要求1所述的过表达ojtps3基因序列的应用的应用的一种优选方案，其中：ojtps3基因的克隆中，使用的克隆引物为：正向：5’-atggccactttagtgcacat-3’；反向：5’-tcaattcatatcctccagag-3’。

17、作为本发明所述过表达权利要求1所述的过表达ojtps3基因序列的应用的应用的一种优选方案，其中：载体构建及蛋白优化中，所述重组中，重组引物为：正向：5’-ctcggtaccctcgagggatccatggccactttagtgcacat-3’，反向：5’-ctatctagactgcaggtcgactcaattcatatcctccagag-3’。

18、作为本发明所述过表达权利要求1所述的过表达ojtps3基因序列的应用的一种优选方案，其中：载体构建及蛋白纯化，所述载体为pcold-tf载体。

19、作为本发明所述过表达权利要求1所述的过表达ojtps3基因序列的应用的一种优选方案，其中：原核表达及蛋白纯化中，大肠杆菌为大肠杆菌bl21。

20、作为本发明所述过表达权利要求1所述的过表达ojtps3基因序列的应用的一种优选方案，其中：原核表达及蛋白纯化中，所述平板中包括氨苄青霉素。

21、本发明有益效果：

22、本发明提供了一种与水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列与过表达该基因的应用，提出的ojtps3基因能够在原核表达体系中进行表达，在具有表达能力的基础上有着较高的萜品油烯表达量，对于科研人员而言能够对于β-石竹烯的合成机制进行进一步的了解。

技术特征：

1.一种与水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列，其特征在于：所述ojtps3基因序列如seq id no.1所示。

2.一种与水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列的应用，其特征在于：过表达ojtps3基因序列在提高水芹或原核微生物表达含量。

3.根据权利要求2所述的与水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列的应用，其特征在于：克隆权利要求1所述的ojtps3基因，构建所述ojtps3基因的蛋白表达载体，转化到原核生物中，纯化得到的蛋白能够在体外催化生成萜品油烯。

4.根据权利要求3所述的与水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列的应用，其特征在于：所述原核生物为大肠杆菌。

5.根据权利要求3所述的与水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列的应用，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的与水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列的应用，其特征在于：所述ojtps3基因的克隆中，使用的克隆引物为：正向：5’-atggccactttagtgcacat-3’；反向：5’-tcaattcatatcctccagag-3’。

7.根据权利要求5所述的与水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列的应用，其特征在于：所述载体构建及蛋白优化中，所述重组中，重组引物为：正向：5’-ctcggtaccctcgagggatccatggccactttagtgcacat-3’，反向：5’-ctatctagactgcaggtcgactcaattcatatcctccagag-3’。

8.根据权利要求5所述的与水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列的应用，其特征在于：所述载体构建及蛋白纯化，所述载体为pcold-tf载体。

9.根据权利要求5所述的与水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列的应用，其特征在于：所述原核表达及蛋白纯化中，所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21。

10.根据权利要求5所述的与水芹萜品油烯合成相关的ojtps3基因序列的应用，其特征在于：所述原核表达及蛋白纯化中，所述平板中包括氨苄青霉素。

技术总结
本发明公开了一种一种水芹萜品油烯合成相关的OjTPS3基因序列及其应用，所述OjTPS3基因序列如Seq ID No.1所示。本发明提供了一种OjTPS3基因的制备方法和用途，获得的OjTPS3基因能够在原核表达体系中进行表达，在具有表达能力的基础上有着较高的萜品油烯表达量，对于科研人员而言能够对于β‑石竹烯的合成机制进行进一步的了解。

技术研发人员：冯凯,李良俊,严雅洁,吴鹏,赵书平
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15