一种化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法

本发明属于生物催化和制药工程领域，具体涉及一种化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法。

背景技术：

1、氟苯尼考，化学名称为d(+)-苏-1-对甲砜基苯基-2-二氯乙酰氨基-3-氟丙醇，结构式如下所示：

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3、氟苯尼考是一种β-氨基醇类抗生素，具有抗菌力强，抗菌谱广，毒副作用小，无残留，不易产生耐药性等特点，是替代氯霉素和甲砜霉素的新一代抗生素，主要用于治疗敏感细菌引起的畜禽和水产动物的细菌性疾病和支原体感染。传统的氟苯尼考化学合成工艺是以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为原料，经过铜盐催化、硫酸酯化、d-酒石酸手性拆分、硼氢化钾还原、环化、氟化、酰胺化等多步反应，合成路线如下所示：

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5、该化学合成路线步骤繁琐，反应条件剧烈，其中涉及的铜盐催化剂在排放前需要严格的回收处理。d-酒石酸拆分剂的回收步骤多且会产生大量的废水，传统的氟苯尼考化学合成法生产成本高、污染大。因此开发低成本的氟苯尼考绿色合成路线，是目前氟苯尼考产业的研究热点。

6、目前对氟苯尼考合成路线的改进主要集中在个别步骤的替代。例如专利cn110577948b利用l-苏氨酸醛缩酶将500mm的对甲砜基苯甲醛和1m的甘氨酸转化为(2s,3r)-对甲砜基苯丝氨酸，在30℃下反应6h，转化率可达75％，de值达60％。专利cn 110951799 b利用l-苏氨酸转醛酶、乙醇脱氢酶和甲酸脱氢酶的多酶级联反应，“一锅法”合成(2s,3r)-对甲砜基苯丝氨酸。专利cn 114875084 a以β-羟基丙酮酸锂和对甲砜基苯甲醛为原料，先后经转酮酶和转氨酶的催化作用合成(1r,2r)-4-甲砜基苯丝氨醇，直接跨过铜盐催化、硫酸酯化、d-酒石酸手性拆分和硼氢化钾还原等步骤，明显缩短了氟苯尼考的合成路线。然而该路线的原材料β-羟基丙酮酸锂价格昂贵、合成成本高，反应转化率低。

7、综上所述，针对现有技术中所存在的相关问题，现在亟需研发出一种成本低、反应条件温和、立体选择性好、安全环保、高效绿色的氟苯尼考合成新方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，以解决现有氟苯尼考合成技术中所存在的反应过程繁琐，环境污染大，成本高，反应转化率低等问题。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，包括：

4、1)β-氟丙酮酸钠盐、对甲砜基苯甲醛与d-丙氨酸通过丙酮酸脱羧酶和转氨酶的级联催化生成氟苯尼考胺；

5、2)以氟苯尼考胺为原料合成氟苯尼考。

6、作为一种可能的实施方式，进一步，步骤2)中所述氟苯尼考胺在二氯乙酸甲酯的作用下经酰胺化反应合成氟苯尼考。

7、作为一种可能的实施方式，进一步，步骤1)中所述丙酮酸脱羧酶和转氨酶来自于采用基因工程手段共表达丙酮酸脱羧酶和转氨酶的重组大肠杆菌全细胞，或者为各自表达丙酮酸脱羧酶和转氨酶的重组大肠杆菌全细胞。

8、作为一种可能的实施方式，进一步，步骤1)中所述丙酮酸脱羧酶包含seq id no.3所示的氨基酸序列或者与所述seq id no.3所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。

9、作为一种较优的实施方式，优选的，所述丙酮酸脱羧酶为swpdc，编码所述swpdc的基因序列如seq id no.4所示。

10、作为一种可能的实施方式，进一步，步骤1)中所述转氨酶包含seq id no.5所示的氨基酸序列或者与所述seq id no.5所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。

11、作为一种较优的实施方式，优选的，所述转氨酶为ceta，编码所述ceta的基因序列如seq id no.6所示。

12、在上述方案的基础上，在另一改进的方案中，氟苯尼考的合成包含3个关键步骤：①以d-丝氨酸为原料，利用氨基酸氧化酶为催化剂，辅以化学氟化反应合成β-氟丙酮酸钠盐；②以β-氟丙酮酸钠盐、对甲砜基苯甲醛和d-丙氨酸为原料，以丙酮酸脱羧酶和转氨酶为催化剂，经多酶级联反应合成氟苯尼考胺；③最后氟苯尼考胺经一步化学的酰胺化反应合成氟苯尼考。合成路线如下所示：

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14、作为一种可能的实施方式，进一步，步骤1)中所述β-氟丙酮酸钠盐是以d-丝氨酸为原料，利用氨基酸氧化酶为催化剂，辅以化学氟化反应合成。其中，化学氟化反应是利用三氟乙酸和氢氧化钠进行化学氟化反应，合成β-氟丙酮酸钠盐。

15、作为一种可能的实施方式，进一步，所述氨基酸氧化酶来自于采用基因工程手段过表达氨基酸氧化酶基因的重组大肠杆菌全细胞；

16、所述氨基酸氧化酶包含seq id no.1所示的氨基酸序列或者与所述seq id no.1所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。

17、作为一种较优的实施方式，优选的，所述氨基酸氧化酶为rtdaao，编码所述rtdaao的基因序列如seq id no.2所示。

18、发明的有益效果在于：

19、本发明通过β-氟丙酮酸钠盐、对甲砜基苯甲醛和d-丙氨酸作为底物，“一锅法”合成氟苯尼考胺，氟苯尼考胺再经一步化学酰胺化反应，合成氟苯尼考，明显缩短了氟苯尼考的合成路线，且反应过程中能够保证高立体选择性，免去拆分步骤，提高原子经济性，具有成本低、反应条件温和、立体选择性好、安全环保等特点，为一种氟苯尼考高效绿色合成新路线。

技术特征：

1.一种化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，步骤2)中所述氟苯尼考胺在二氯乙酸甲酯的作用下经酰胺化反应合成氟苯尼考。

3.根据权利要求1所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，步骤1)中所述丙酮酸脱羧酶和转氨酶来自于采用基因工程手段共表达丙酮酸脱羧酶和转氨酶的重组大肠杆菌全细胞，或者为各自表达丙酮酸脱羧酶和转氨酶的重组大肠杆菌全细胞。

4.根据权利要求1所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，步骤1)中所述丙酮酸脱羧酶包含seq id no.3所示的氨基酸序列或者与所述seq id no.3所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。

5.根据权利要求1或4所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，所述丙酮酸脱羧酶为swpdc，编码所述swpdc的基因序列如seq id no.4所示。

6.根据权利要求1所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，步骤1)中所述转氨酶包含seq id no.5所示的氨基酸序列或者与所述seq id no.5所示的氨基酸序列同源性高于80％的多肽蛋白。

7.根据权利要求1或6所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，所述转氨酶为ceta，编码所述ceta的基因序列如seq id no.6所示。

8.根据权利要求1所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，步骤1)中所述β-氟丙酮酸钠盐是以d-丝氨酸为原料，利用氨基酸氧化酶为催化剂，辅以化学氟化反应合成。

9.根据权利要求8所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，所述氨基酸氧化酶来自于采用基因工程手段过表达氨基酸氧化酶基因的重组大肠杆菌全细胞；

10.根据权利要求8或9所述的化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，其特征在于，所述氨基酸氧化酶为rtdaao，编码所述rtdaao的基因序列如seq id no.2所示。

技术总结
本发明公开了一种化学酶法偶联合成氟苯尼考的方法，以β‑氟丙酮酸钠盐、对甲砜基苯甲醛和D‑丙氨酸为底物，在丙酮酸脱羧酶和转氨酶的级联催化下，“一锅法”合成氟苯尼考胺，再经酰胺化反应合成氟苯尼考。合成路线包括：β‑氟丙酮酸钠盐和对甲砜基苯甲醛在丙酮酸脱羧酶的催化下生成(1R)‑3‑氟‑1‑羟基‑1‑对甲砜基苯基‑2‑丙酮；(1R)‑3‑氟‑1‑羟基‑1‑对甲砜基苯基‑2‑丙酮和D‑丙氨酸继续被反应体系中的转氨酶转化为氟苯尼考胺，最后氟苯尼考胺经一步化学的酰胺化反应合成氟苯尼考。本发明与传统的氟苯尼考化学合成法相比，步骤更少，且中间涉及构型的步骤均由高立体选择性的酶催化替代，省却拆分步骤，反应过程更加绿色环保，原子经济性更高，适宜推广应用。

技术研发人员：林娟,赵鸿儒,许炼,苏冰梅
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15