灰毡毛忍冬开花的调控基因及其应用

本发明涉及植物基因工程领域技术，尤其是指一种灰毡毛忍冬开花的调控基因及其应用。

背景技术：

1、灰毡毛忍冬为忍冬科(caprifoliaceae)、忍冬属(lonicera)多年生常绿灌木或藤本，是中国传统中药“山银花”的主要基原植物之一，其药用部位为干燥花蕾及初开的花，具有很高的药用价值和经济价值。普通灰毡毛忍冬抗性差、蕾期短、易凋谢、产量和有效成分含量低；而花蕾型灰毡毛忍冬新品种‘龙花’、‘金翠蕾’等，其花期花冠一直不展开，花蕾整齐均呈棒状，花期长达15～25天，解决了同时段大规模集中采摘困难等问题，为灰毡毛忍冬植物提供了新的优良种质资源。为更好的指导实际生产和迎合未来分子育种的发展趋势，研究花蕾型灰毡毛忍冬蕾期长、花蕾整齐不开放等现象背后的分子机制则显得十分必要。

2、mads-box基因家族是植物中一类生物功能丰富的转录调控因子，参与调控植物的生长发育的各个时期，尤其与花的形态发生密切相关，mads-box基因在调控开花时间、花冠展开等花器官发育方面发挥着重要的调控作用。目前，mads-box家族基因已从大量不同植物种类中克隆得到，但灰毡毛忍冬mads-box相关基因的报道微乎其微，仅见ap1、agl19基因和蕾期延长相关基因agl15克隆和表达分析以及内参基因筛选等零星报道。从现有文献报道来看，调控花蕾型灰毡毛忍冬蕾期长、花冠不展开的关键基因尚需进一步挖掘与验证。

3、agl82基因是该基因家族中的一员，目前尚未有对其的研究报道；申请号为201710819491.6的发明公开了一种甘蔗开花调控蛋白scft-2及其编码基因，现有技术未从灰毡毛忍冬中克隆得到agl82基因，并以灰毡毛忍冬agl82基因为切入点，通过载体构建、遗传转化拟南芥等方法研究灰毡毛忍冬agl82基因的功能及其在植物花器官发育中的应用；因此，基于此现状，迫切需要开发一种灰毡毛忍冬开花的调控基因及其应用，以满足实际使用的需求。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明针对现有技术存在之缺失，其主要目的是提供一种灰毡毛忍冬开花的调控基因及其应用，其提供了灰毡毛忍冬花器官发育相关的agl82基因及其编码蛋白序列，以及制备agl82基因的方法和制备过程中所需的引物，并通过agl82基因过表达载体的成功构建、遗传转化拟南芥等技术手段验证了agl82基因可促进植物开花的功能。

2、为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案：

3、一种灰毡毛忍冬开花的调控基因，所述调控基因为agl82，其基因序列如seq idno.1所示；所述调控基因的编码蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、作为一种优选方案：所述调控基因能够通过rna提取及反转录进行克隆。

5、作为一种优选方案：所述调控基因进行克隆的方法包括如下步骤：

6、第一：以灰毡毛忍冬为材料，提取rna，并将提取的rna进行反转录生成cdna第一链，作为pcr扩增的模板；

7、第二：将获得的灰毡毛忍冬agl82基因进行序列分析并设计pcr反应引物；

8、第三：以灰毡毛忍冬cdna第一链为模板，采用agl82pcr反应引物进行pcr扩增，pcr扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，并按琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收pcr产物；回收pcr产物与ptopo载体连接并转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取阳性克隆并测序。

9、作为一种优选方案：所述pcr反应引物为lmagl82-f，其引物序列为：atgggacgagctagagtcagaa。

10、作为一种优选方案：所述pcr反应引物为lmagl82-r，其引物序列为：catggctaatcagtaattaattgaac。

11、作为一种优选方案：所述pcr扩增pcr扩增的反应体系为：2×phanta max buffer12.5μl，dntp mix 0.5μl，svp-f和svp-r各1μl，phanta max super-fidelity dnapolymerase 0.5μl，cdna模板1.5μl，ddh2o 8.0μl；pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；72℃彻底延伸5min；12℃持续。

12、所述灰毡毛忍冬开花的调控基因的应用，所述调控基因用于调控灰毡毛忍冬开花期。

13、作为一种优选方案：所述调控基因应用于植物过表达载体的构建，该调控基因能够促进灰毡毛忍冬提前开花。

14、作为一种优选方案：所述植物过表达载体的构建具体方法为：采用同源重组的方法构建pcambia1301-lmagl82植物过表达载体，使用同源重组引物扩增出目的片段，然后重组至线性化载体pcambia1301载体上，将重组反应转化大肠杆菌并挑取单克隆鉴定测序。

15、作为一种优选方案：所述调控基因用于获取转基因植株。

16、本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，由上述技术方案可知，本申请提供了灰毡毛忍冬花器官发育相关的agl82基因及其编码蛋白序列，以及制备agl82基因的方法和制备过程中所需的引物，并通过agl82基因过表达载体的成功构建、遗传转化拟南芥等技术手段验证了agl82基因可促进植物开花的功能，同时也提供了该基因在植物性状改良中的一种应用路径，表明了该基因具有良好的应用前景，为培育花类药材和花类观赏植物新品种提供了宝贵的基因资源。

17、为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。

技术特征：

1.一种灰毡毛忍冬开花的调控基因，其特征在于；所述调控基因为agl82，其基因序列如seq id no.1所示；所述调控基因的编码蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.根据权利要求1所述的灰毡毛忍冬开花的调控基因，其特征在于；所述调控基因能够通过rna提取及反转录进行克隆。

3.根据权利要求2所述的灰毡毛忍冬开花的调控基因，其特征在于；所述调控基因进行克隆的方法包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的灰毡毛忍冬开花的调控基因，其特征在于；所述pcr反应引物为lmagl82-f，其引物序列为：atgggacgagctagagtcagaa。

5.根据权利要求3所述的灰毡毛忍冬开花的调控基因，其特征在于；所述pcr反应引物为lmagl82-r，其引物序列为：catggctaatcagtaattaattgaac。

6.根据权利要求3所述的灰毡毛忍冬开花的调控基因，其特征在于；所述pcr扩增pcr扩增的反应体系为：2×phanta max buffer 12.5μl，dntp mix0.5μl，svp-f和svp-r各1μl，phanta max super-fidelity dna polymerase0.5μl，cdna模板1.5μl，ddh2o 8.0μl；pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，35个循环；72℃彻底延伸5min；12℃持续。

7.一种如权利要求1-6任意一项所述的灰毡毛忍冬开花的调控基因的应用，其特征在于；所述调控基因用于调控灰毡毛忍冬开花期。

8.根据权利要求7所述的灰毡毛忍冬开花的调控基因的应用，其特征在于；所述调控基因应用于植物过表达载体的构建，该调控基因能够促进灰毡毛忍冬提前开花。

9.根据权利要求8所述的灰毡毛忍冬开花的调控基因的应用，其特征在于；所述植物过表达载体的构建具体方法为：采用同源重组的方法构建pcambia1301-lmagl82植物过表达载体，使用同源重组引物扩增出目的片段，然后重组至线性化载体pcambia1301载体上，将重组反应转化大肠杆菌并挑取单克隆鉴定测序。

10.根据权利要求7所述的灰毡毛忍冬开花的调控基因的应用，其特征在于；所述调控基因用于获取转基因植株。

技术总结
本发明公开一种灰毡毛忍冬开花的调控基因及其应用，涉及植物基因工程技术领域，该灰毡毛忍冬开花的调控基因为AGL82，其基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述调控基因的编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；调控基因能够通过RNA提取及反转录进行克隆；所述调控基因用于调控灰毡毛忍冬开花期，用于植物过表达载体的构建，该调控基因能够促进灰毡毛忍冬提前开花；提供了灰毡毛忍冬花器官发育相关的AGL82基因及其编码蛋白序列，以及制备AGL82基因的方法和制备过程中所需的引物，并通过AGL82基因过表达载体的成功构建、遗传转化拟南芥等技术手段验证了AGL82基因可促进植物开花的功能。

技术研发人员：刘思思,龙丽君,马英姿,李昌珠,刘汝宽,王晓明,曾慧杰,乔中全,肖静晶,涂佳
受保护的技术使用者：湖南省林业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16