一种在珠子参细胞中合成人参皂苷CK的方法

本发明涉及一种在珠子参细胞合成人参皂苷ck的方法，属于生物医药制备。

背景技术：

1、五加科(araliaceae)人参属(panax)药材的主要活性成分为三萜皂苷，包括人参皂苷、竹节参皂苷等，这些药用成分具有防治心脑血管疾病、抗疲劳、抗氧化、增强免疫力以及保肝护肝等多种药理功效。根据苷元结构的不同，可将人参属药用植物的三萜皂苷分为达玛烷型皂苷、齐敦果烷型皂苷两大类。

2、人参皂苷化合物compound k(以下简称ck)是一种“非天然”的原人参二醇(ppd)型皂苷，具有抗癌、抗炎、抗氧化、皮肤保护、神经保护等功效。传统共识认为，ck为天然人参皂苷进入体内以后的代谢产物，而人参属植物不具备直接合成ck的能力。

3、自然条件下，珠子参细胞不能够合成人参皂苷ck，ck目前主要通过rb1、rb2、rd和rc的去糖基化制备，方法主要包括加热、酸水解、碱水解、微生物转和酶促转化。但是，这些方法制备的分离工艺复杂，制备时间长，制备量小，溶剂需求量大。此外，人参皂苷ck在人参属植物中含量低，人参属植物的栽培时间长，以及化学提取过程存在效率低、环境污染等问题，使得ck的价格较高，其在医药和保健行业的应用受到一定限制。

技术实现思路

1、本发明提供一种在珠子参细胞合成人参皂苷ck的方法，该方法是将干扰ugtpj3基因的rnai片段、基因ugtpj20转入珠子参细胞中，获得能合成人参皂苷ck的珠子参细胞；其中干扰ugtpj3基因的rnai片段的核苷酸序列如seq id no:1所示，基因ugtpj20的核苷酸序列如seq id no:3所示；

2、或者将干扰ugtpj3基因的rnai片段、干扰cyp716a53v2基因的rnai片段、基因ugtpj20转入入珠子参细胞中，获得能合成人参皂苷ck的珠子参细胞；其中干扰ugtpj3基因的rnai片段的核苷酸序列如seq id no:1所示，干扰cyp716a53v2基因的rnai片段的核苷酸序列如seq id no:2所示，基因ugtpj20的核苷酸序列如seq id no:3所示。

3、本发明目的通过以下技术方案实现：

4、1、从珠子参中提取总rna，逆转录合成珠子参cdna，以合成的cdna第一链为模板，通过pcr扩增分别获得基因ugtpj20、干扰ugtpj3基因的rnai片段、干扰cyp716a53v2基因的rnai片段，其中干扰ugtpj3基因的rnai片段的核苷酸序列如seq id no:1所示，干扰cyp716a53v2基因的rnai片段的核苷酸序列如seq id no:2所示，基因ugtpj20的核苷酸序列如seq id no:3所示；

5、2、构建过表达载体pcambia2300s-ugtpj20、rnai干扰载体phellsagte-ugtpj3、rnai干扰载体phellsagte-cyp716a53v2，转化农杆菌，通过pcr筛选出阳性单克隆；

6、3、利用农杆菌介导的遗传转化法，将pcambia2300s-ugtpj20、phellsagte-ugtpj3或者pcambia2300s-ugtpj20、phellsagte-ugtpj3、phellsagte-cyp716a53v2导入珠子参细胞表达，通过抗生素筛选和qrt-pcr筛选阳性转基因细胞系；

7、4、提取珠子参转基因和非转基因细胞系中的皂苷，分析转基因和非转基因细胞系人参皂苷ck的含量差异。

8、本发明首次实现了“非天然”的人参皂苷ck在人参属植物细胞中的合成，ck具有安全性高、生物功能多样的优点，但ck在珠子参药材中不含有，发明人发现珠子参(p.japonicus)具有合成ck所需的基因元件，本发明基于已被解析的人参皂苷的合成途径，对合成途径中关键酶活性进行探究，发现了人参属植物中不合成ck的可能机制；珠子参细胞中合成ck所需的酶ugtpj20与底物ppd亲和力较差，而同样以ppd为底物合成原人参三醇(ppt)以及人参皂苷rh2的两个酶cyp716a53v2和ugtpj3，其与ppd的亲和力均较强。由于三种酶催化活性的显著差异，导致以ppd为底物的皂苷合成代谢流主要用于合成ppt和人参皂苷rh2，而不能够利用ppd合成ck；然后通过基因调控方法，在没有引入外源基因的情况下，巧妙地在珠子参细胞中合成人参皂苷ck，丰富了珠子参中皂苷的种类和含量；本发明为深入了解和认识人参皂苷的生物合成网络提供了技术方法和新的策略。

9、本发明通过rnai手段抑制与ppd亲和力较强两个关键基因ugtpj3、cyp716a53v2的表达，弱化人参皂苷rh2和ppt的合成，引导皂苷合成代谢流进入ck合成通路；同时采用基因过表达的方法提高人参皂苷ck合成通路上的关键酶基因ugtpj20的表达，强化ck合成通路，使皂苷合成代谢流更多地用于ck合成，从而实现ck在珠子参细胞中的合成和积累。本发明解决了珠子参不合成ck的技术问题，对于人参属物种合成非天然人参皂苷ck提供了新途径。

技术特征：

1.一种在珠子参细胞中合成人参皂苷ck的方法，其特征在于：将干扰ugtpj3基因的rnai片段、基因ugtpj20转入珠子参细胞中，获得能合成人参皂苷ck的珠子参细胞；其中干扰ugtpj3基因的rnai片段的核苷酸序列如seq id no:1所示，基因ugtpj20的核苷酸序列如seq id no:3所示。

2.一种在珠子参细胞中合成人参皂苷ck的方法，其特征在于：将干扰ugtpj3基因的rnai片段、干扰cyp716a53v2基因的rnai片段、基因ugtpj20转入珠子参细胞中，获得能合成人参皂苷ck的珠子参细胞；其中干扰ugtpj3基因的rnai片段的核苷酸序列如seq id no:1所示，干扰cyp716a53v2基因的rnai片段的核苷酸序列如seq id no:2所示，基因ugtpj20的核苷酸序列如seq id no:3所示。

技术总结
本发明公开了一种在珠子参细胞中合成人参皂苷CK的方法，该方法是将干扰UGTPj3基因的RNAi片段、基因UGTPj20转入珠子参细胞中，或者将干扰UGTPj3基因的RNAi片段、干扰CYP716A53v2基因的RNAi片段、基因UGTPj20转入珠子参细胞中；获得能合成人参皂苷CK的珠子参细胞；其中干扰UGTPj3基因的RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，干扰CYP716A53v2基因的RNAi片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，基因UGTPj20的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；本发明实现了CK在珠子参细胞中的合成和积累，对人参属物种合成非天然人参皂苷CK提供了新途径。

技术研发人员：葛锋,巫晓莹,陈勤,胡泽群,崔秀明
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15